芥菜BjCHI1启动子的分离及功能分析研究.pdfVIP

摘 要 芥菜 (Brassicajuncea)几丁质酶基因BjCHll受伤害、茉莉酸、虫食、真菌侵染等 的诱导，因此BjCHIl启动子是一个诱导型启动子。克隆BjCHII启动子并阐明其功能， 对了解芥菜几丁质酶基因BjCHIl在植物与病原反应中的表达调控模式具有重要的应用 价值和理论意义。 将芥菜基因组DNA分别用DraI、EcoRV和SmaI酶切，酶切片段与一特殊的接 头连接。按照BjCHII基因的cDNA序列设计基因特异引物，取连接产物为模板，以接 头引物和基因特异引物进行PCR扩增，在DraI酶切一连接体系里得到一PCR特异产物， 回收PCR产物，克隆到pGEM-TEasy载体上，并测序，将其序列与GenBank中的已知 序列进行比较，发现该序列3端‘120bp的序列与BjCHIIcDNA5’端的已知序列完全 一致，证明分离到了BjCHII基因的上游序列。用PLACE数据库对该启动子进行分析， 发现它含有类似于TATA-box的元件，是一个新的启动子 (1098bp)e HindIII和BamHI双酶切pBI121质粒，去掉约0.8kb的35S启动子片段，回收大 片段，并与同样经HindIII和BamHI双酶切的BjCHll启动子片段连接，构建成与报 告基因gus融合的植物表达载体pBICHPo 电激法将植物表达载体pBICHP转入根瘤农杆菌EHA105，含有pBICHP的EHA105 经活化并用乙酞丁香酮诱导后，用1mL塑料注射器将大约100gL菌液注入刚展开的烟 叶两叶脉之间。注射完后烟草植株放回培养箱，280C,16h/d光照，3天后在注射区取烟 草叶片进行GUS组织化学检测分析表明，芥菜BjCHII启动子片段能够驱动91“基因的 表达，证明所克隆的1098饰的芥菜BjCHII启动子片段具有启动子活性。 关键词:芥菜，BjCHIl几丁质酶，诱导型启动子，接头PCR，农杆菌渗入法 Abstract TheBrassicajunceachitinasegeneBjCHIIisinducedbywounding,treatmentwith jasmonate(JA),insectfeedingorbyfungalinfection;indicatingthepromoterofBjCHIIisan induciblepromoter.TounderstandtheregulationexpressionpatternofBjCHIlunderling plant-pathogeninteractions,itisimportanttocloneandilluminatethefunctionoftheBjCHII promoter. BrassicajunceagenomicDNAwasdigestedwithDraI、EcoRV andSmaI respectively.AspecialadapterwasligatedtotheendsofthedigestedDNAfragments,andthe ligatedDNAwasusedasatemplateforPCRwithadapterprimerandgenespecialprimer designedaccordingtothesequenceoftheBrassicajunceaBjCHIIcDNA.OnespecificPCR productwasgeneratedwhentheDraIadapterligatedDNAusedastemplate.Thespecific PCRproductwasisolatedandclonedintopGEM-TEasyvectorandthensequenced.The sequencewascomparedwiththesequencesinGenBankandfoundthata120bpsequenceat the3endaccordedwith5endoftheBjCHIIcDNA,demonstratedthatthisPCR amplifiedDNArfagmentisthepromoteroftheBjCHIlgeneandanovelpromoter(1098bp) wasobtained.AlikeTATAboxwasfoundinthispromoterbyPLACEanalysis. Planttr