大麦黄矮病毒GPV株系全长ORF2基因植物表达载体的构建.pdfVIP

大麦黄矮病毒GPV株系全长ORF2 蓦因植物表达栽体的构建 ‘ 吴茂森 成卓敏 扭苗英” 肖 红 (中圈农业科学院植物保护研究所，植物有虫容生物学国家盆点实脸室，业京1000941 扭要 将大童黄接病毒GPV株系的落因序列乌同派性轰大的RPV株系荞因序列进行比极，确定出性 码复俐阵基因的开艘阅谈框架ORF2、依ORF2序封设奸上、下浮引物，对用RT-PCR方法扩增出 ORF2基因片往并分别括入到含有35S启动于的pJ3(35SN质牡扣香有Emu启动午的PE二一=s-N 质拉.构建了用于转化小麦的植物表达载体pPPI11和pPPI12, 关.词 大麦黄撼病奉GPV抹系 ORF2 桂物衣达或体 大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus,BYDV)是一种世界性的植物病原病毒，可侵染大 部分的禾本科作物及杂草。由大麦黄矫病毒引起的小麦黄矮病是114上最童耍的病毒病客，流行 并为害于世界上主要的麦产区，并造成严重的经济损失。因蚜传特性的不同，在国外BYDV被分 为5个不同的株系:RPV,RMV,MAV,SGV和PAV。根据其血清学关系不同5个株系又被分 成二个组:前2个为一组，后3个为一组。从我国分离到的GPV株系在血清学上与国外的全部5 个株系均无反应，为我国所特有的一个株系。病害防治，特别是对于病毒病害的防治，由于没有 有效的药剂，抗病品种是首选措施。但对于大麦黄矮病毒来说，目前在小麦中尚未发现夭然存在 的抗性基因，因此，利用人工构建的抗性基因培育小麦抗病品种就显得更为童要.将GPV株系的 外壳蛋白(CP)基因序列与RPV株系的进行比较，发现GPV株系与RPV株系其有较离的同砚 性，且高于所有5个国外株系任何2个之间的同原性。据此，作者将所侧得的GPV株系墓因组序 列(未发表)与国外发表的RPV株系序列进行了比较，确定出了编码复制醉基因的开放阅读框架 ORF2，并构建了用于转化小麦的植物表达载体。 1 材料与方法 1.1 材料 大麦黄矮病毒系本组繁殖提纯的GPV株系.MMLV反转录酶和TaqDNA聚合醉购自Gibco -BRL公司。琼脂据和各种内切酪购自Promega公司。大肠杆菌菌株为JPA101，本组保存.质 粒pJ3(35SN和pEmu-mcs-N分别由澳大利亚联邦科工组织植物所P.Waterhouse博士和R. Brettell博士惠增。 1.2 病弃核欲提取和RT-PCR 病毒核酸提取参见 (吴茂森等，1997)。根据已确定的GPVORF2核酸序列，分别设计了含 有BamHI醉切位点的上游 (5端)引物:5-GGGGATCCATGAAACACGGTGTAGCGTG GGCTG-3和 含有EcoRI酶切位点的下游 (3端)引物:5-GGGAATTCTCAGGTTA ATTTTGTGGTG一3,参照 (张淑香等，1987)的方法进行RT-PCR，热循环程序为:(941C/ 50秒，50-C/30秒;72C/2.5分钟)X35个循环;720C,10分钟。1%琼脂枪凝胶电泳进行检测。 .国家 863蓦金资助项目.长节现在中国农科院蕊菜所工作，100081 430 1.3ORF2片段的回收及克隆 采用液氮冻融法回收DNA片段:电泳后的PCR产物在紫外检测仪上将目的条带切下，切碎 后装人小离心管中，加人200(l丁E及等体积的苯酚/抓仿，振荡混匀后置于液氮中冷冻10分钟， 融化后14000r/分钟离心5分钟，取上层水相乙醉沉淀，干燥后溶于TE之中。将回收的ORF2片 段和叮3OSSN质粒分别用SamHI和EcoRI进行双醉切3小时，苯阶/抓仿抽提后乙醉沉淀，干 操后洛于ddH20之中。利用T4DNA连接醉将ORF2连接到p13.(35SN之冲构成衰达质较PPPI ，。构‘姗雌举碑焦荆界脚-R八力公可的GenePulaei转化术加林夔冲今;O1户株，通过挑选 单菌落进行舜呼卜吟内步仲鸿演一笋PNA条带MA的辜1稗行碑}t;l}?}t;几娜娜x窄入片段的 大小，料钾鲜卑珍幸、盘后尽BeniHI和EcbRI将OIZF2龙pPPI毕资匆下问收K‘lenow大 片段进俄研砰哗撰却娜如一I醉切的pEmu-mcb-N之中构娜暇姗伴冲护那12.简禅方法转化、 鉴定盆4!秘+C赞钾1#段中的柳仰}E定片段的描X-blall否正确二