改良游离细胞扫描电镜制样方法适用于凋亡细胞观察.pdfVIP

第 32卷 第 6期 电 子 显 微 学 报 V01．32．NO．6 2013年 l2月 JournalofChineseElectronMicroscopySociety 2Ol3．12 文章编号：1000—6281(2013)06—0492．04 改良游离细胞扫描电镜制样方法适用于凋亡细胞观察 赵德璋，罗子 国 ，杨杰顺 (重庆医科大学生命科学研究院，重庆 400016) 摘 要 ：利用常规游离细胞扫描 电镜制样方法制备的凋亡细胞样品，镜下凋亡检 出率较低 ，细胞容易脱落变形，不 能满足观察要求。本文采用200~mol／L双氢青蒿素作用前列腺癌 Pc一3细胞48h，诱导细胞凋亡；通过改 良的制样 方法制样并观察凋亡细胞超微结构。结果显示，凋亡细胞和凋亡小体 阳性率 明显提高，细胞贴附紧密、分布均匀， 凋亡细胞超微结构比透射 电镜更直观形象。 关键词 ：扫描 电镜 ；样品制备 ；游离细胞 ；凋亡 中图分类号：Q25；Q336 文献标识码 ：A doi：10．3969／j．1000—6281．2013．06．007 细胞凋亡 (Apoptosis)，或称程序性细胞死亡 自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。双氢 (programmedcelldeath，PCD)，是细胞 自身的一种主 青蒿素 (DHA)纯品由重庆医科大学附属第一医院 动的生理性死亡 ，是一种多步骤发生的、受 自身基 因 薛斌博士馈赠 ，纯度为 99．5％。以少量二 甲基亚砜 调控的机制…，近年来 已成为生命科学研究的热 (DMSO)溶解 DHA，配成浓度为0．2mol／L的母液 ， 点。 目前形态学检测仍然是细胞凋亡最基本、最可 超声波助溶 ，4cI二保存备用。实验前用含 5％ 胎牛 靠的检测手段之一 。扫描 电子显微镜 (scanning 血清 (FBS，Hyclon公司)的 HamF12培养基 (Gibco electronmicroscope，SEM)既可以在低放大倍数下观 公司)稀释至所需浓度。 察细胞群体 ，得到具有统计学意义的观察结果 ；也可 1．2 实验步骤 以通过高倍放大，研究单个细胞的形态学改变，已 1．2．1 细胞培养 经在体外培养细胞的基础研究 及血液病的临 前列腺癌 PC．3细胞生长于含 10％ (：V)FBS 床诊疗 ¨“ 等方面得到了广泛的应用。 双抗溶液 (青霉素 G100IU／mL，链霉素 100x／g／mL) 然而，在细胞群体中，由于凋亡细胞 、正常细胞和 的HamF12培养基 中，37℃，5％ CO，，95％饱和湿 死细胞之间的形态、比例等都有较大差异，且凋亡的 度条件下常规培养 ，细胞贴壁生长 ，每 2～3天换液 细胞在制样过程中容易脱落变形，甚至破碎 ，往往导 一 次，当细胞生长汇合时，按 1：3传代 ，每周传代 1～ 致扫描电镜下凋亡细胞检出率明显偏低、细胞脱落变 2次。 形等，不能满足观察要求。本文对常规的游离细胞扫 1．2．2 凋亡率与坏死率检测 描电镜制样方法进行改良，旨在探索并建立适用于凋 取对 数生长 期 PC一3细胞 在含 5％ FBS 的 亡细胞观察的扫描电镜制样方法，为建立和完善凋亡 HamF12培养液 中培养。细胞贴壁后 ，200x／mol／L 细胞的形态学检测技术提供方法学支持。 DHA作用48h。0．25％胰蛋 白酶消化并收集细胞 ， 吹打成单细胞悬液 ，台盼蓝计数细胞 ，使收集细胞总 1 材料和方法 数在 1×10。以上 ，PBS洗涤 2