VHH抗体库构建.ppt

研究内容三 N端无aa残留Cap蛋白的表达策略 由于生产N 端携带多于aa或C端携带超过36aa会干扰Cap VLP的形成，所表达Cap蛋白N端必须要最终暴露出来,因此必须使用切割标签或使用intein 介导的自释放体系。 （1） SUMO释放系统 由于SUMO标签可在Ulp1酶作用下从C端断裂，不留任何残余氨基酸，同时SUMO又可以增加Cap可溶性和Cap VLP的形成，因此在本项目趋向于使用SUMO裂解系统。 pLac-his-SUMO-Cap His-SUMO 标签 pLac-his-MBP-SUMO-Cap His-MBP-SUMO 标签 （2） Intein 介导的Cap蛋白释放系统 (1) Lac-TEE-His-SUMO-intein-Cap (2) Lac-TEE-His-MBP-intein-Cap (3) Lac-TEE-His-MBP-SUMO-intein-Cap Lac-TEE-SUMO-intein-Cap-His-intein-PT-18A/ELK18 Lac-TEE-MBP-intein-Cap-His-intein-PT-18A/ELK18 * * 双峰驼VHH单链抗体库构建 目录 研究背景及意义 研究内容 技术路线 结果 讨论 1.研究背景及意义 Hamers等（1993）偶然发现骆驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体(HCAbs)，此类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH单结构域形成 。 VHH抗体是迄今为止发现的具有结合抗原功能的最小分子量抗体片段, 分子量为15kD，仅为常规抗体的1/10，其分子高度4.8nm，直径在2.2nm，故被称为纳米抗体( nanobody) VHH抗体特点：①分子量小，易表达；②高水溶性和稳定性（耐高温、耐极度 pH 值）；③可识别独特构造的抗原表位 图1 . 传统抗体与骆驼抗体比较模型图。骆驼抗体缺少传统抗体上存在的整个轻链和CH1区。 Fig. 5. 传统抗体VH区与骆驼抗体VHH区3-D结构分析. VH 或VHH表面标志性的四个氨基酸(V37, G44, L45,W47) 用绿色标记。CDR3 区用蓝色标记。左端为VH或VHH示意图。右上图为传统抗体VH区3-D结构。右下图为骆驼VHH区3-D结构。 2.研究内容 1、Camel immunization：双峰驼连续三次免疫PRRSV,PCV2，CSFV及FMDV 2、外周血淋巴细胞的分离及总RNA提取 3、反转录成cDNA 4、RT-PCR扩增VHH片段 5、纯化的VHH片段与pGADT7-Rec共转Y187酵母菌 Total RNA isolation and RT-PCR Immunise dromedary with immunogens Isolate lymphocytes CH1 hinge CH2 CH3 VHH hinge CH2 CH3 Immunise c. bactrianus with immunogens Collect blood 900bp 600bp Purify 600bp fragment on gel RE1 HL1 HL2 Ligation PCR product (VHH）genes in phage vector 400bp 400bp Restriction Enzyme (RE) Homologous length (HL) Transform in E.coli And generate library In-vivo recombination in yeast RE2 Pool colonies and aliquoy into 1 ml sigle-use vials 3.技术路线 QDO/X/A + Mating DDO/X/A 1ml library Bait culture 噬菌体VHH库和酵母VHH库筛选流程 4.材料与方法 4.1 材料 4.1.1 动物免疫 免疫动物为一只母性成年双峰驼和一只雄性半龄幼骆驼。免疫原分别为猪瘟、圆环和口蹄灭活疫苗。 4.1.2 淋巴细胞分离 经3次免疫后测三种疫苗免疫后的抗体水平，待抗体水平较高时，采集外周血，分离外周血淋巴细胞。 4.1.3 酵母双杂交系统相关试剂均购自clontech公司，其它试剂购自TAKARA公司。 Primer Sequence (5′-3′) TM（°C） CALL001 5’-leader sequence-specific GTCCTGGCTGC