第六章 花药与花粉培养.ppt

第六章 花药与花粉培养 第二节 小孢子的形成和花粉的发育途径 一、小孢子的正常发育 二、花药培养时花粉发育途径 1、营养细胞发育途径（A型） 花粉 生殖核（小）------不分裂或分裂几次后退化 营养核（大）-----经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖 而突破花粉壁，细胞持续分裂形成类胚体或愈 伤组织，最后形成单倍体植株 常见的植物：烟草、大麦、光叶曼陀罗、小麦、小黑麦和辣椒 2、生殖细胞发育途径 只在天仙子中出现 3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径 4、花粉均等分裂途径 第三节 花药培养 概念： 花药培养（anther culture）：指用无菌操作技术将成熟或未成熟的花药接种在人工培养基上，诱导花粉单性发育形成植株的过程。 一、花药培养的一般操作程序 1.培养基的选择 2.材料选取 3.材料预处理 4.材料消毒 5.接种 6.脱分化培养 7.再分化培养 8.花粉植株移植 9.染色体加倍 1.培养基的选择 Nitsch H、MS被广泛用于双子叶植物的花药培养。 B5：被广泛用于十字花科及豆科植物的花药培养。 禾谷类植物的花药培养，早期多采用Miller培养基、MS培养基、N6培养基和马铃薯2号培养基。 Sunderland(1984)设计了C17培养基，用于水稻、小麦、大麦、小黑麦、黑麦、玉米和甘蔗等禾谷类作物的花药培养。 3.材料预处理 低温： 高温 生长素 其他方法处理 常能提高愈伤组织和苗分化的频率。 4.材料消毒 取回的材料，在接种前进行表面灭菌，一般用70～75％酒精，将表面擦洗即可。 5.接种 在无菌接种室或超净工作台上进行接种操作，采用直径3cm的试管，每管接种花药30～60粒。 必须注意：在操作过程中，不应使花药受到损伤，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的愈伤组织。损伤的花药要淘汰。 6.脱分化培养 根据材料不同，选取适宜的基本培养基、适当的生长素比例和最适的温度进行培养，经10～30天可诱导愈伤组织形成。 7.再分化培养 愈伤组织增殖到1～3mm大小时，应及时进行再分化培养以获得花粉植株。 要选择含适当激素水平的培养基进行培养，约经20～30天就能诱导苗的分化。 8.花粉植株移植 当花粉植株的根系生长良好时，就要及时进行炼苗并移至苗床或大田。 试管中花粉植株的移植是一个由异养转变为自养的过程，必须细心管理，保持幼苗的水分平衡和促进新根的发生。 9.染色体加倍 人工方法：用0.02～0.4%秋水仙素处理植株，双子叶植物处理生长点或腋芽，禾本科植物在分蘖期处理。 单倍体植株可以通过自发的核内有丝分裂产生的二倍体。 二、花药培养的方法 琼脂固体培养法 在培养基中加入0.5～0.7%琼脂，使培养基呈半固体状态。加入的琼脂量因琼脂质量而定。 琼脂浓度一般以花药有1/3浸入而又不沉没于琼脂中为宜。 液体培养法 液体培养的培养基厚约0.5cm,若能让花药漂浮在液面上,效果最好。 加入聚蔗糖(Ficoll),可使花药不下沉而漂浮在液面上 。 第四节 花粉培养 含义： 花粉培养(pollen culture)是指把花粉从花药中剥离出来，在无菌的人工环境中，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养使其进一步生长发育的技术。 优点： 在于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植株。 花粉是研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机制的较为理想的材料。建立花粉培养实验系统也可为深入开展细胞工程、遗传工程和分子生物学的研究提供技术基础。 一、花粉培养的一般操作程序 花粉培养与花药培养的一般操作程序基本相同。 花粉培养在材料消毒后要将花粉从花药中分离出来，再进行接种，其基本操作程序可参照花药培养。 二、花粉的分离方法 自然散落法 把花药从未开的花中在无菌条件下取出，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，让花粉继续培养生长。如果是液体培养基，可接种大量花药，经1～2天，大量花粉散落入培养基中，经离心浓缩收集，再接种培养。 机械挤压法 优点：操作简便 缺点：花粉中混杂有体细胞并且所得的悬浮液中花粉密度也不易控制。 三、花粉培养的方法 直接培养法 从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接接种到培养基中进行培养的方法为直接培养。 预培养法 将花药在基本培养基中预培养3～6天，然后取出花粉，经离心冲洗后，在液体培养基中进行培养，密度为105个/ml。培养三周后，可见到各个阶段的花粉胚；4～5周后，可发育成小植株。 看护培养