RNA干涉载体的构建及水稻基因的功能鉴定研究.pdfVIP

摘 要 到目前为止，己经有十几种原核生物包括大肠杆菌和真核生物如拟南芥、水稻 的全序列己测完。下一个挑战性的任务就是深入理解生物中各种基因的功能和相互 之间的关系。近年发现的dsRNA(doublestrandRNA)能够比反义RNA或顺义RNA更 有效地关闭基因表达的现象，即RNA干涉(RNAinterference.RNAi)正在成为研究 基因功能的有效工具。RNAi己经为线虫和果蝇中基因的研究带来了一场革命，两个 研究小组最近报道了线虫第一和第三染色体4000多个基因的系统分析。 为了有效的利用RNA干涉进行植物基因的功能研究，本研究中构建了两个用于 RNAi的通用载体pRNAi。载体分别以Ubi和CAMV35S为启动子，都包含两个多克隆 位点 (MCS)，方便基因的正向和反向克隆。用pRNAi载体可以迅速有效获得目的基 因的dsRNA结构，所需的步骤包括目的基因的PCR扩增，PCR产物和载体的酶切、 连接到第一个MCS,筛选重组子，将重组载体中装载的片段用通用引物扩增，酶切 后反向克隆到pRNAi载体的第二个MCS。然后可以用于转化水稻愈伤组织，再生得 到转化苗。 为了验证带Ubi启动子的干涉载体的有效性，选取了水稻的2个转录因子进行 RNAi实验。一个属于AP2/EREBP基因家族(编号为chl-2)，具有一个APL结构域， 是一种乙烯应答元件结合蛋白(EREBP);另一个是拟南芥CO基因的同源物(编号为 ch10-1)，具一个锌指结构域 (zincfinger)，可能调控水稻的抽穗时间。通过设计 特异引物，以粳稻(石狞白毛)基因组DNA为模板，扩增出转录因子片段，克隆到载 体的MCS1中，用MCS1两侧的通用引物再次将转录因子扩增出，利用通用引物上设 计的酶切位点，再次克隆到MCS2中 (与第一次克隆的方向相反)。将装载了目的基 因正向和反向片段的载体转化农杆菌，再用农杆菌侵染水稻愈伤组织，各获得 300 多株To代转化苗。 用RT-PCR和Northern杂交的方法对目的基因ch1-2的mRNA降解情况进行了 检测。在所检测的7株转化苗中，目的mRNA被降解的程度有所不同，3个植株的内 源目标基因的mRNA几乎完全被降解，2个转化株中的目的基因的mRNA只是被大幅 度降解，但依然处于可检测到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi转化载体对 关闭基因表达是有效的。 本研究中所构建的用于基因沉默的通用载体pRNAi，结合成熟的农杆菌转化水 稻的技术，为水稻基因功能的鉴定提供了良好的工具。 关键词:功能鉴定 RNA干涉 双链RNA 转录因了 缩略词与英汉对照 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic 2，4一二氯苯氧乙酸 ABA Abscisicacid 脱落酸 ACC 1-aminocyclopropane-l-carboxylicacid 氨基环丙烷梭酸 AS Acetosyringone 乙酞丁香酮 BA 6-Benzylaminopurine 6-节氨基V吟 by Basepair 碱基对 BSA Bovineserumalbumin 牛血清蛋白 carb carbenicillin 梭节青霉素 cDNA complementaryDNA 互补DNA cefo Cefazolinsodium 头抱哇林钠 cis-TGStranscriptionalgenesilencing 顺式转录水平基因沉默 dATP DeoxyakenisinetripHospHate 脱氧腺昔三磷酸 dCTP Deoxycyt