蛋白质组学新技术-DIGE+2008级生物信息本科.pptVIP

蛋白质组学新技术-DIGE 主讲：胡水旺 南方医科大学病理生理学教研室 2011年10月31日 第一部分：背景知识 系统生物学应用举例 应用系统生物学的方法可以预测药物的作用机制、病人对药物的应答，包括毒副作用和疗效等。 例如，美国纽约基因网络科学公司（Gene Network Sciences）构建了一种人类癌细胞模型，该模型内含有500多种基因和蛋白质，可将以前分别孤立研究的生物过程联系在一起，利用该生物网络模型，能够更好地理解细胞的生物学行为。 第二部分：蛋白质组学的兴起 “如果说人类基因组计划是把人类送上了月球，那么蛋白质组计划将促使人类成功返回地球；如果说人类基因组计划是写满人类生命奥秘的天书，那么蛋白质组计划便是解读这本天书的方法”。贺福初院士用形象的比喻，是蛋白质组学变得浅显易懂。 蛋白质组学的研究内容 1.蛋白质：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质差异显示、同工体比较、新型蛋白质发掘和数据库构建。 2.基因：完善功能基因组计划。 3.重要生命活动的分子机制：细胞周期、肿瘤的发生发展、物种进化等。 4.医药靶分子的寻找与分析：新型药物靶标、肿瘤恶性标志物。 蛋白质组学的研究任务 1.诠释基因功能； 2.寻找功能蛋白质：如LPS刺激； 3.研究生理和病理现象:如肿瘤； 4.开发蛋白质资源：如EPO、胰岛素等； 5.进行基础研究：如贺福初院士领衔的“国际人类肝脏蛋白质组计划”。 背景知识 蛋白质组学的研究的机遇和挑战： 机遇：基因组计划的快速进行，大量基因序列和EST的确定为蛋白质的快速鉴定提供了良好的基础。 挑战：从单一蛋白质的研究转变到细胞和组织的整体蛋白质研究，在理论和技术上提出了挑战。 第三部分:荧光差异双向电泳 蛋白质组学常用的两大技术平台 双向电泳原理 双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。 1. 第一向等电聚焦：IEF是根据蛋白质的等电点（pI）的不同而将他们分离的一种电泳技术。蛋白质在环境pH 值低于pI 时带正电，高于pI 值时带负电。在加上电压的情况下，蛋白质会向其最稳定的状态即等电点位置移动。 双向电泳原理 2. 第二向SDS：SDS －PAGE是根据蛋白和多肽的分子量大小将其分离的。它是在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶中进行的。由于SDS 掩蔽了蛋白本身所带的电荷，同时形成了阴离子复合物，使单位质量的蛋白带有大约相等的阴离子电荷。 第一向等点聚焦系统组件 Ettan IPGphorⅢ等电聚焦系统包括： 1.Immobiline DryStrip干胶条，含固相pH梯度，通常称为IPG胶条； 2.两种胶条固定附件——Manifold 胶条槽和固定长度式胶条槽； 3.Ettan IPGphor Ⅲ电泳仪，包括一个高压直流电源、珀耳帖（Peltier）固相温控装置、和可同时设定10 种IEF 方案的程控系统。 第一向：水化 1. 用移液器吸取适量制备好的DeStreak 水化溶液，至泡胀盘中或常规胶条槽中，将溶液沿槽道的全长均匀分布。 2. 从阳极开始（+ 端），小心揭去Immobiline DryStrip 干胶条的覆盖膜。 3. 小心地将Immobiline DryStrip 胶条放入盘/ 槽中，面冲下将水化溶液仔细地均匀分布于胶条下。要使凝胶完全被覆盖，可轻轻地抬起按下胶条，并在溶液表面前后滑动。注意不要在胶条下面产生气泡。 4. 用Immobiline DryStrip 覆盖油覆盖胶条。 5. 溶胀时间10~20 小时。 第一向：加样 Manifold 胶条槽可容纳7~24cm 长的胶条，最多同时容纳12 条，主要可通过三种方式上样： （1） 水化上样，通常用于制备和分析电泳，适用于宽范围或窄范围胶条； （2） 样本杯上样（阳极或阴极），通常用于分析电泳，适用于碱性或强酸性胶条； （3） 纸桥上样（阳极或阴极），通常用于制备电泳，适用于碱性或强酸性胶条。 标准胶条槽：采用水化上样，泡涨和上样一次完成。 第一向：聚焦参数设置 根据胶条的pH梯度范围、胶条长度及上样量来确定聚焦参数。一般是先主动水化，以24cm pH 3-11 NL的胶条举例，参数设置如下： 30v， 12hr； step 100v，1hr； g