第二章实验室和基本操作.ppt

;第一节 实验室和基本设备 第二节 基本操作 第三节 培养基 第四节 离体培养体系的建立 ;第一节 实验室和基本设备;（一）准备室;2、主要仪器设备;洗刷池;天 平;酸度计;玻璃器皿;;2、主要用具和设备;接种用具;显微镜;（1）房间 干爽安静，清洁明亮，墙壁光滑平整不易积 污灰尘，地面平坦无缝便于清洗和灭菌； （2）定期消毒：室内安装紫外灯，接种前开灯20min， 或定期用甲醛与高锰酸钾产生的蒸汽薰蒸； （3）操作前在缓冲间穿上工作服； （4）超净工作台使用前开机(打开紫外灯)30min以上。;（三）培养室;3、主要设备;培养架（木材，装日光灯）;恒温振荡器;;第二节 基本操作;二、灭菌 1、干热灭菌法 用于玻璃器皿或器具，恒温干燥箱中150℃，保温2h； 2、高压蒸汽灭菌法 用于玻璃器皿、器具和培养基，121℃保持20-30min。 3、过滤除菌法 用于高温下容易分解或变性的物质，如生长调节物质、酶等。此法比较麻烦，不常用。;三、无菌操作 1、实验前30min打开紫外灯，工作时关闭； 2、用酒精棉（浸泡70%酒精）擦拭工作台； 3、手和小臂用70%酒精消毒； 4、培养瓶的瓶口在酒精灯上烧烤灭菌；;5、镊子、解剖刀等用具浸泡在90%或95%酒精中，在酒精灯上烧烤灭菌，后放支架上待用。;第三节 培养基; 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。; 培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基。 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。;一 培 养 基的 构 成;种类;活性炭的特性： 木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力，粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5-10g／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。 ;活性炭的作用： 可减少组织变褐和培养基变色，可以吸附外植体产生的致死性褐化物； 降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。 对生根有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。 活性炭的副作用：活性炭能吸附生长调节物质，大量的活性炭会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。把活性炭任意量放入培养基，会带来不良的后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。;二 培 养 基 的类型;三 培 养 基母液 的配制; 铁盐配制方法：在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒氢氧化钠（苛性钠），溶解后加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。;母液配制时应注意的一些问题： ①一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43- 一起混合后，会产生沉淀，一定要充分溶解再按一定顺序放入母液中。 ②用蒸馏水或重蒸馏水配制；药品应选取等级较高的化学纯或分析纯；药品的称量及定容都要准确；先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。 ③母液配好后放人冰箱内低温保存（4℃），用时再按比例稀释。 ④贮备液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用。;母液和培养基配制的基本操作 ;大量元素;MS 大量元素;微量元素;MS 微量元素;MS 铁盐;维生素;氨基酸;常用的生长素类调节剂;NAA的作用;BA（6-苄基氨基嘌呤） KT（激动素） ZT（玉米素） Zip（z-异戊烯腺嘌呤）;BA的作用;第四节 离体培养体系的建立;第四节 离体培养体系的建立;