高效液相色谱法(中文).pptVIP

第十八章 高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography ; HPLC ） 氨基键合相: 与硅胶的性质有较大差异，前者为碱性，后者为酸性。在做正相洗脱时，表现出不同的选择性。 氨基键合相色谱柱是分析糖类最主要的色谱柱，也称为碳水化合物柱。 　固定相——十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等化学键合相，有时也用弱极性或中等极性的键合相为固定相。 流动相——以水作为基础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂， 常用甲醇－水、乙腈－水等。 2.流动相的极性与保留因子的关系 极性强的组分的保留因子k 小，先洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力减弱，使组分 k 增大，tR 增大；反之，k 减小， tR 减小。 1．非极性键合相 如十八烷基（C18）﹑辛烷基（C8）﹑甲基（C1）与苯基等。 十八烷基硅烷(octadecylsilane，ODS 或C18)键合相是最常用的非极性键合相。它是由十八烷基硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经多步反应生成的键合相。非极性键合相通常用于反相色谱。 非极性键和相的烷基链长对溶质的保留、选择性和载样量都有影响。 长链烷基可使溶质的k 增大，分离选择性改善，使载样量增加，长链烷基键合相的稳定性好。 短链非极性键和相的分离速度较快，对于极性化合物可得到对称性较好的色谱峰。 二、化学键合相色谱法的流动相 HPLC 对流动相的基本要求： ①化学稳定性好，不与固定相发生化学反应。 ②对试样有适宜的溶解度。要求使k在1~10范围内，最好在2~5的范围内。 ③必须与检测器相适应。例如用紫外检测器时，只能选用截止波长小于检测波长的溶剂。 ④纯度要高，黏度要小。低黏度流动相如甲醇﹑乙睛等可以降低柱压，提高柱效。 截止波长:用 1cm 光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸光度 A＝1 时，此时的波长称为该溶剂的截止波长。 如：水190nm，甲醇205nm，乙腈190nm (二)流动相对分离的影响 n 由固定相及色谱柱填充质量决定， α主要受溶剂种类的影响， k 受溶剂配比的影响。 因为不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，有可能使被分离的两个组分的分配系数不等，即α≠1。 改变流动相中各种溶剂的配比，能改变其洗脱能力，组分的 k 也改变。在正相色谱法中，增加流动相中强溶剂的比例，其洗脱能力增强，使 k 变小。 Snyder提出的溶剂极性参数是根据罗胥那德（Rohrschneider）的溶解度数据推导出来的，将罗氏提供的极性分配系数( )以对数的形式表示。 纯溶剂的极性参数(P)定义为： 反相键合相色谱法的溶剂强度常用 S 表示 常用溶剂的 S 值列于表20-2 在正、反相色谱法中，溶剂的洗脱能力大体相反。 例如，在正相洗脱时，水的洗脱能力最强（P最大，为10.2），而在反相洗脱时，水的洗脱能力最弱（S 最小，为0）。 2．混合溶剂的强度 用于正相键合相色谱法的多元混合溶剂的强度，用极性参数 来表示，其值为各组成溶剂极性参数的加权和： 反相色谱法的混合溶剂的强度因子 用类似方法计算： （1）固定相传质阻抗 通常采用化学键合相，它的“固定液”是键合在载体表面固定液官能团的单分子层，所以，固定液的传质阻抗可以忽略，于是 C = Cm + Csm 18.3 高效液相色谱仪 一、输液系统 (一)　高压输液泵送液 输液泵应具备如下性能： ①流量精度高且稳定，其RSD应小于0.5%，这对定性定量准确性至关重要； ②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min； ③能在高压下连续工作； ④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。 （二）梯度洗脱装置 实现梯度洗脱的装置，即高压梯度和低压梯度。 高压二元梯度装置是由两台高压输液泵分别将两种溶剂送入混合室，混合后送入色谱柱，程序控制每台泵的输出量就能获得各种形式的梯度曲线。低压梯度装置是在常压下通过一比例阀先将各种溶剂按程序混合，然后再用一台高压输液泵送入色谱柱。 　梯度洗脱装置 二、分离和进样系统 （一）进样器 进样阀和自动进样装置两种 一般高效液相色谱分析常用六通进样阀， 大数量试样的常规分析往往需要自动进样装置。 （二）色谱柱 1.色谱柱的构造 按主要用途分为分析型和制备型， 常规分析柱内径2~5mm，柱长10~30cm； 窄径柱 (narrow bore column) 内径1~2mm，柱长10~20cm； 毛细管柱内径0.2~0