基因工程实验.2012.05.21.2136.pptVIP

实验一、碱裂解法提取质粒 实验目的： 掌握碱裂解法小量制备质粒DNA。 实验原理： 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 在pH值为12.0~12.6碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液调节pH值至中性时，变性的染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去； 变性的闭合环质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存在溶液中，离心后的上清中便含有所需要的质粒DNA，再通过用酚、氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤而获得纯的质粒DNA。 实验材料 含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、冰盒、卫生纸。 实验仪器 微量移液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，制冰机等。 实验试剂 1.溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。 作用：充分悬浮细胞 2. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。 作用：裂解细胞，使DNA变性 3. 溶液Ⅲ：乙酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。 作用：中和裂解液，使质粒复性，同时染色体DNA与蛋白质、SDS共同沉淀 4.氯仿/异戊醇（24：1）：氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 5. 无水乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA 6. 70%乙醇：充分洗去盐离子 7. 无菌ddH2O； 8. TE缓冲液：； 实验步骤： （1）取1.3ml培养液倒入1.5ml 离心管中，12000rmp离心1min。弃上清，吸取0.9 ml菌液，再次收集菌体。将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。 （2）再加入150μL的溶液Ⅰ，剧烈振荡打散菌体，使菌体分散混匀，加入300μL的溶液Ⅱ轻轻颠倒混和均匀（注意：动作一定要轻，不可剧烈颠倒！），放置5min左右，加入225 μL的溶液Ⅲ混和均匀，(放置于冰上10 min，使杂质充分沉淀)，12000 r/min离心5 min。 （3）取上清液（580μL）加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提，充分混匀后室温12000 r/min离心5 min。 （4）离心结束后，将上清（480μL）转移至一干净离心管中，再加入2倍体积的无水乙醇（960μL） ，充分混匀，置冰上静置5 min，12000 r/min离心5 min。 （5）弃掉上清再加入1 mL 70％乙醇洗涤沉淀，12000 r/min离心5 min。 （6）弃去乙醇，充分干燥后加30 μL ddH2O溶解，-20℃ 保存，为下一个实验使用。 思考题 碱裂解法抽提的原理是什么？ 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？ 无水乙醇、70%的乙醇作用是什么？ 实验二、质粒DNA的琼脂糖电泳鉴定 实验目的： 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术 实验原理： 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。 在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的染料以及电泳缓冲液的组成。 实验材料：待检测的DNA 实验仪器：电泳仪，水平电泳槽，紫外透射仪，微波炉，电子天平等 实验试剂：TAE电泳缓冲液（1×）；溴酚蓝上样缓冲液（6×）；EB（溴化乙锭）染色液；λDNA Marker/HindIII 实验步骤： 制胶：称取0.24g琼脂糖放入三角瓶中，再加入30mlTAE电泳缓冲液（1×），放入微波炉中加热煮沸，至琼脂糖颗粒完全熔化。 待琼脂糖液冷却到约60℃,轻轻倒入胶槽，并插上梳子。凝固约20min. 待琼脂糖完全凝固后取出梳子，把胶放在电泳槽中，加TAE电泳缓冲液至稍没过胶面（不要太多或太少）,准备电泳。 4.用移液枪将样品DNA与上样缓冲液混匀(5μl样品+1μl溴酚蓝上样缓冲液)，将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面以下，缓慢将液体加入点样孔（注意：加样后枪头离开液面后再松开枪）。注意记录点样顺序。 5.接通电泳槽与电泳仪的电源（DNA带负电），当溴酚蓝染料移动到距胶前沿1-2cm处，停止电泳。 6.电泳结束后，将胶置于EB染色液中染色10min，然后取出凝胶用水冲洗后，置于紫外透射仪中观察电泳结果。