OATP-C分子阳离子赖氨酸-49突变体削弱其底物摄取能力.pdf

维普资讯 2007年6月第 6卷第3期 ChinJDigSurg,June2007,Vo1．6,No．3 · 227 · · 论著 · OATP—C分子阳离子赖氨酸49突变体 削弱其底物摄取能力 杨聪 陈文生 邓国宏 汪荣泉 肖天利 【摘要】 目的 研究人肝脏特异的有机阴离子转运蛋白基因OATPC·分子膜外区保守的49位阳离 子赖氨酸，对其有机阴离子底物摄取能力的影响。方法 从人肝脏mRNA 中克隆OATP·C野生型基因全 长cDNA序列，通过定点突变将高度保守的第49位赖氨酸残基突变为中性氨基酸 ·苏氨酸 ，构建其 c端的 GFP融合蛋白的真核表达载体，转染 HEK293细胞，观察突变体的细胞膜定位能力及底物摄取功能的变 化。结果 OATP．C野生型及突变体基因均能定位表达于HEK293细胞质膜；[H]硫酸盐雌酮底物摄取实 验显示，突变体5min底物摄取量较野生型下降74．18％，浓度依赖的[H]硫酸盐雌酮底物摄取动力学分 析表明，突变体Km增高和Vmax降低。结论 OATP．C蛋白膜外区第49位赖氨酸是其关键的功能氨基酸， 是其重要的功能结构单位。 【关键词】 OATP．C；定点突变； 底物摄取； HEK293细胞 【中图法分类号】 Q735 【文献标识码】 A M utantofOATP-C positiveionlysine-49impairsuptaking abilityofitssubstrate YANGCong ，CHEN Wen·sheng，DENGGuo— ，WANGRong·quan，XIAOTian·li．’InstituteofDigestiveDisease，SouthwestHospi- tal，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China Correspondingauthor：CHEN Wen·sheng，E—mail：wenshengchen@ hotma il．com 【Abstract】 Objective Toinvestigatetheeffectofthemutantoforganicaniontransportingpolypeptide．C (OATP·C)positiveionlysine-49localizedonthepolypeptideextracellularloopinimpairinguptakingabilityofits subsrtate．M ethods FulllengthcDNA ofthewildtypeOATP—C wasclonedfrom human livermRNA byRT· PCR．Then，thehighlyconservedlysine-49residuesweremutatedtothreoninebysite·directedmutagenesistech— niquetoconstructtheeukaryoticexpressionvectorsofCterminal GFPfusionprotein．Targetingba ilityanditsup· takingsubstratecapba ilityofcellplasmamembranewereobservedbytrna sfectingthoseconstructsintoHEK293 cells．Results Bothwild·typeOATP—CproteinnadmutantwerehighlyexpressedonHEK293cellplasmamem· brnae．[H]estronesulfatesubstrateuptakingtechniqueshowedthattheamountofsubstrateuptakenbymutantat 5minhaddecreasedby74．18％，compraedwiththewildtypeOATP·Cprotein．[H]estronesuflatesubstrate uptakin