芳香酮还原酶产生菌红酵母AS22241的筛选及应用研究.pdfVIP

芳香酮还原酶产生菌红酵母AS2.2241的筛选及应用 倪哗 许建和 华〔东理工大学生物催化研究室上海200237E一mail:jianhexu@ecust.edu.en) 摘要 本文通过建立起一个以苯乙酮蒸气为唯一破源的新颗筛选模型。从土壤中分离得到一林对 〔- 澳代笨乙酮和笨乙酮具有高立体选择性还原活性的酵母菌，经鉴定为红酵毋属，命名为红酵母 (Rhodowratasp.)AS2.2241。通过时该酵母细胞的培养进程的考察，确定AF还原膝在发酵20h时达到 最高畴活41.0U/L，并发现苯乙酮叶降活有明显诱导作用。通过对该还原酶进行了部分纯化，踌的纯 化倍数达到52.6倍，醉活回收率为28%.该醉的获适底物为短链脂肪酪和含有笨甲耽基的芳香醛类 及酮类物质，其中对乙醛表现出最高的活性;该还原醉的最适pH和最适沮度分别为pH6.5和5090. 最后，以Rhodo,oralasp.AS2.2241细胞为催化别制备得到了((R)一(一)-2-澳-1一苯乙醉和 (S) 一 (一)-I一苯乙碑纯品。 琴甘词 (_洛祥艾乙MA 茉乙润 不对称还原 酮还原阵 醛还原踌 红酵母 1 引言 手性化合物在医药、农用化学品等领域有着广泛的应用。。一卤代苯乙酮及苯乙酮的不对称 还原是一条合成光学纯芳香醇的有效途径，而且由它可制备手性环氧化物和1,2一二醇。这些 物质是合成一些天然光学活性产品和许多重要手性药物包括治疗心率不齐、支气管炎、哮喘等 药物的中间体。八十年代以来，有关的合成方法开始出现，包括生物法和化学法。通常，生物催 化法以其高对映选择性，反应条件温和及环保等特点而具有明显的优势。 在这方面已有成功的经验。一些醇脱氢酶和醛还原酶被分离得到并应用于制备手性芳香醇。 面包酵母经常用于 (一卤代苯乙酮和其它芳香酮的不对称还原。一些其它微生物，例如Cryptoco- cusnwcerans,Corynebacteriumsp.,Hansenulacapsulate，和otrichumsp.也被应用于制备光学纯芳 香醇。然而，上述研究工作大多无法获得对映选择性很高的芳香醇 (98%ee)。由于手性芳香 醇的光学纯度在制备手性药物中的重要性，我们认为进行菌种的筛选是有意义而且是有必要的。 从最丰富的菌种来源— 土壤中筛选，是我们知道的获得对非天然底物作用的酶的最好方法。 本研究室从土墩中筛选得到一株能以高对映选择性还原 (一澳代苯乙酮和苯乙酮的酵母菌，经 鉴定命名为红酵母 (Rhodotontlasp.)AS2.2241。通过对该菌株的芳香酮还原酶的产酶进程进行考 察，获得了该菌株的最佳产酶条件。通过对该还原酶进行部分纯化，研究了该酶的pH,温度、 底物专一性及动力学参数等性质。以红酵母AS2.2241的静息细胞作催化剂制备得到了光学纯 (R)-2-澳一1一苯乙醇 (99.9%ee)和 (S)-1一苯乙醇 (99.5%e.)o 2 材料与方法 2.1 材料 菌种筛选过程中的土样由上海、南汇、无锡、嘉兴、广西等地采得。苯乙酮 (分析纯)从 E.海试剂一厂购买;a一澳代苯乙酮从AcrosOrganics公司购买。 2.1.1培养基及培养条件 贫乏培养基:(NK),SO,2g/L;KH,10,2g/L;NaCl1g/L;MgSO,7H,00.2g/L; 发酵培养基:葡萄搪15g/L;蛋白陈5g/L;酵母膏5g/L;K,HP04.0.5g/L;KH,PO,0.5g/L; NaC曰9/1;MgS04-7H,00.5g/L;平板或斜面培养基中另加人1.6%的琼脂。 2.2 方法 2.21筛选方法 49 取新鲜土样稀释后涂于贫乏平板培养基上，与装有苯乙酮的小烧杯一同放置于塑料袋中， 密封。30℃恒温室放置待菌落长到能明显地分辨后挑出具有不同形态的单菌落，接人丰富培养基 中培养后加底物转化，进行薄层层析分析。将有产物生成的菌株挑选出，进行复筛，用手性 HPLC分析反应的转化率和产物的对映体过量值lzl 2.2.2 分析方法 筛选部分所用的分析方法主要有以下两种: 定性分析一薄板层析法:以石油醚/乙酸乙酷 (6:1,v/v)为展开剂，5g/L芳草醛的浓硫酸 溶液为显色溶液川。 定量分析一高效液相色谱