苦楝皮对妊娠早期小鼠子宫自然杀伤细胞和γ干扰素的影响研究.pdfVIP

苦楝皮对妊娠早期小鼠子宫自然杀伤 细胞和Y一干扰素的影响+ 翟向和钟秀会++宫新城 (河北农业大学河北保定071001) 苦楝皮为楝科楝属植物苦楝树(MeliaazedarachL)及川楝树(MeliatoosendSiebet Zucc)的根皮及树皮。味苦、性寒，有毒，为杀虫燥湿之良药。主治蛔虫，亦可驱蛲虫， 治游风热毒、风疹恶疮及疥癣等川。其主要药理成分为川楝紊(toosendanin)，分子式 C30H38011·分子量为574．63。川楝素纯品为白色针状晶体，无色、无臭、味苦，易溶于乙 醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，最早于1953年由四川省中药研究所提取，主要用于驱虫。 近年来用于农业杀虫，但川楝素对哺乳动物还有一定的毒性，经测定川楝素对小鼠1次灌 4mg／kg，说明其对不I司动物的毒性差异较大，其敏感程度次序为猪、猫、猴、犬、兔、大 鼠、小鼠”1。国外很早就开始了对楝科植物印楝(AzadirachtaindicaAJuss)的研究，尤以 印度对印楝的研究最为活跃和深入。发现印楝素可致大鼠100％妊娠终止131，川楝素和印楝 素同属于四环三萜类化合物，其化学结构及生物活性有许多相似之处。苦楝皮是否有妊娠 毒性，毒性物质究竟如何影响子宫局部免疫细胞和免疫分子，二者到底存在什么内在联 系?本研究主要探讨苦楝皮的致流产作用以及对子宫局部免疫水平的影响。 1材料和方法 1．1材料 ¨．1试验动物 选取8周龄的未经产纯种昆明系小鼠，购自石家庄河北医科大学，常规饲养1周后， 眼观检查结合阴道涂片作发情鉴定。阴道涂片经姬姆萨染色，镜下观察全部为无核角质化 上皮细胞定为发情，与公鼠l：l合笼过夜，于次日清晨检查，见有阴栓者定为怀孕，记为 孕0d。 1．1．2试验药品 小鼠IFN—Y检测试验盒，购自北京岳泰科技有限责任公司：小鼠抗人CD57IgM单克 隆抗体，购自北京岳泰科技有限责任公司；生物紊化山羊抗小鼠IgM，购自北京中山生物 技术有限公司；链菌亲和素—过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒，购自福州迈新生物技术 开发公司。中药苦楝皮，从定州市大世界中药专柜购人，等量混合。水浸lh后，水煎2 次，合并滤液，浓缩至lml含生药lg。 ·国家自然科学基金资助(编，··通讯作者． ·412· 1．2方法 1．2．1试验动物分组与处理 将孕7d小鼠随机分为2组，第1组为对照组，分别灌服蒸馏水O．5ml；第2组为实验 组，分别灌服苦楝皮水煎液0．5ml。以上两组分别于灌药后6、9、12、24h剖杀小鼠(详 见表1)。取右侧子宫角匀浆，测定子宫内细胞因子的含量；取左侧子宫角用波恩液固定， 做免疫组化试验。 1．2．2流产判定 胚胎体积变小、颜色紫黑、出血坏死、呈血团状、镜检无胎膜结构者为胚胎吸收或死 亡。胚胎个体大，粉红色，镜检胎膜及胎儿轮廓清晰，无出血、淤血者为正常胚胎。 1．2．3切片制备 埋，旋转切片机制备5Ⅱm纵切组织片，粘贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，56。C，lh烘 干，备用。 1．2．4免疫组化染色 应用LSAB法(Labelledmethod)对CD57*NK细胞进行免疫组化染色， streptavidian 自然杀伤细胞计数采用钟秀会报道的方法u51。 1．2．5IFN—v的测定 取右侧子宫，剪除子宫系膜及脂肪，纵向切开子宫，剥去胎儿，剪碎子宫角，加入5 倍子宫质量的含有PMSF(蛋白酶抑制剂O．75 u咖1)的PBS(pH7．6)。在冰水中匀浆， 12000 r／m，4C离心15min，移取上清液分装备用。IFN．Y的测定按照产品说明书操作。 1．2．6统计方法 使用Excel统计软件和SAS软件包进行统计。 2结果 2．1小鼠流产情况 孕7d小鼠在灌服苦楝皮水煎液后，分别在6、9、12、24h宰杀。试验组6h宰杀12 只，其中有8只发生胚胎死亡。胚胎为暗紫色；9、12、24h分别宰杀15只，各有14只发 生流产。对照组于6、9h分别宰杀6只，未见子宫出血现象，子宫呈粉红色，胎儿完好； 12、24h分％U宰杀6只，各有1只见子宫出血，其余5只子宫均呈粉红色，胎儿完好(表 1)． 衰1各组小■溅产情况统计