胡萝卜高效再生体系的建立及其轮状病毒免疫相关蛋白基因的遗传转化研究.pdfVIP

中 文 摘 要 胡萝 卜高效再生体系的建立及其轮状病毒 免疫相关蛋白基因的遗传转化 摘 要 轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体，尤其是发展中国家， 每年受轮状病毒危害的婴幼儿数量非常巨大。目前，对轮状病毒感染最有效的预防和控 制措施，是发展有效的疫苗。vp7和vp4是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原，， ‘ 是主要的病毒蛋白，能诱导产生工茄抗体和IgA抗体，与保护性免疫有关。这三个基因 的研究受到了基因工程疫苗研究者的广泛关注。 本试验以红秀CT黑田五寸人参和新透心红胡萝 卜的下胚轴为受体材料，将编码轮 状病毒主要蛋白的vp7,vp6和 ，4基因，利用农杆菌介导法转入胡萝 卜，获得了转基 因植株。并从无菌苗的获得、愈伤组织诱导、选择压、共培养时间、愈伤组织再生及再 生苗的管理等各个阶段的培养条件进行了系统研究和优化，筛选并得到了以胡萝 卜下胚 轴为外植体稳定完整的再生体系和遗传转化体系。主要研究结果如下: 1通过对植株再生各个时期因素的研究和优化，建立了完整的胡萝 卜再生体系。 确定种子的最佳灭菌条件是 1%AgNO,振荡消毒15.20min;红秀CT黑田五寸人参的 最适愈伤组织诱导培养基及激素组合为B5+0.lmg/L2,4-D+O.2mg/LKT，新透心红的最 适愈伤组织诱导培养基和激素组合为MS+O.lmg/L2,4-D;MS培养基有利于再生植株的 生根;再生植株在培养瓶中的炼苗时间以7^10d为宜。 2.建立了农杆菌介导的高效胡萝 卜遗传转化体系，并将 ，入 vp6和vp4基因成功 导入胡萝 卜。7-9d苗龄的胡萝 卜下胚轴浸染农杆菌15^20min，共培养2-3d后， 转入附加 75mg/I,Kan+500mg/LCarb的愈伤组织诱导培养基上，待形成抗性愈伤组 织后，继代到附加120mg/LKan+300mg/LCarb的植株再生培养基上，50d后可得到 Kan抗性苗。 3 经过几次Kan的筛选，得到Kan抗性植株421棵。并对其进行了PCR检测。204 棵转vp7基因的Kan抗性植株中，有62棵为PCR阳性;120棵转，6基因的Kan抗性植 株中，有33棵为PCR阳性;97棵转 vp4基因的Kan抗性植株中，有21棵为PCR阳性。 4，对转vp7基因的植株进行了Southernbl。七和RT-PCR检测，证明目的基因己经 整合到胡萝 卜基因组上，并在转录水平上检测到表达。 关键词:轮状病毒;免疫相关蛋白基因;胡萝 卜;遗传转化;农杆菌介导法;植株再生 英 文 摘 要 EstablishmentofEfficientRegenerationSystemofCarrot HypocotylsandItsTransformationwithRotavirusrelated PreoteinGenes YANGYan-mei Abstract Rotaviurs(RV)infectionisamajorcauseofdehydratingdiarrheainchildrenalloverthe world,especiallyindevelopingcountry.vp7andvp4aremajoroutercapsidproteinandthey areprimarycandidatesforinclusioninasubunitorrecombinant.vp6ismainviursprotein, andcaninducebodytoproduceantibody.Sointroducingvp7,vp4andvp6genesintocarrot todevelopedibleplantvaccineofrotaviurseswouldchangethetraditionalmeansof productionofvaccinesandthecostofvaccineproductionwouldbereducedgreatly.Itis prov