胡萝卜抗冻蛋白的新型生物抗冻剂的研制研究.pdfVIP

胡萝I＼抗冻蛋白的新型生物抗冻剂的研制乖 张党权1，谭晓风1，彭万喜2，刘其梅2，马清芝1 (1．中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南长沙410004； 2．中南林业科技大学流变力学与材料工程研究所，湖南长沙410004) 摘要： 研究了基因工程方法削备的胡萝卜抗冻蛋白 但避免发生重结晶，这要求AFP具有很强的RI活性； 在大肠杆菌和水稻悬浮细胞团的低温和超低温冻存实 而这正是植物AFP的特征。基于此，本文开展了通过 验中提高细胞抗冻的性能．结果表明，在大肠杆菌的冻 基因工程方式将胡萝卜抗冻蛋白研制成天然生物抗冻 存实验中，三个处理温度中胡萝卜抗冻蛋白都明显提高 剂的初步研究。 了细胞的存活率，与阳性对照基本一致：而在水稻悬浮 2实验 单细胞的冻存实验中，胡萝卜抗冻蛋白比阳性对照展示 了更好的保护细胞的能力，其恢复后的细胞活力和相对 2．1试剂与材料 细胞活力高，细胞死亡率低，而且在后续复苏培养过程 中都能进行有效的子代细胞分裂．实验结果表明，通过 基因工程方法大量生产的胡萝卜抗冻蛋白可有效适用 室保存。蛋白质相对分子质量标准购自TaKARa公司， 于真核细胞的低温保存和超低温保存． 关键词： 抗冻蛋白；抗冻剂；低温保存；细胞活力； 基因工程 过硫酸胺、考马斯亮兰R．250购自美国A面鲫osco公司， 中图分类号： Q819 文献标识码：A 透析袋、超滤离心管购自美国Pall公司，BCA试剂盒 文章编号： 1001．973l(2007)增刊．198禾03 c18 购自巧e脱公司，半制备型}疋【C色谱柱(．mpiter 1鲰30nm 1 引 言 常用试剂均为分子生物学纯或分析纯。 在生物体的低温与超低温保存过程中，传统冻存方 2．2实验方法 法易导致胞外冰晶的产生易引起细胞破裂，从而导致细 2．2．1胡萝卜抗冻蛋白的原核表达 胞死亡或组织、器官的整体性功能丧失。新近出现并日 参照文献【5】的方法进行。 益成熟的玻璃化法冻存技术给生物的个体及细胞的长 2．2．2胡萝卜抗冻蛋白的纯化、复性及活性检测 期低温保存带来了希望，但保护剂毒性、降温方式和去 Dc√岍的纯化及性参照文献【61的方法进行。对纯 玻璃化等问题一直制约着它的研究进程及应用【1l。目前 化和复性后的Dc√旧进行分析性反向m，LC和 绝大多数研究表明，胞内冰晶、胞外冰晶和溶液效应是 引起低温保存中细胞发生损伤的主要因素【2J。以往的冻 检测重组Dcm平的热滞活性，采用低温循环技术检测 存方法和冻存试剂都是从如何最大程度上避免冰晶的 重结晶抑制活性。将检测后的Dc创即进行低温冻干， 产生上进行研究u】，但效果不明显，这是由于在冻存过 4℃保存备用。 程中冰晶的产生是不可避免的。因而，抑制冰晶的生长 2．2．3水稻悬浮细胞团的制备 和冰晶的重结晶才是解决冰晶对细胞伤害的根本办法。 参照文献【7】的方法进行。 然而，常规的生物化学试剂等是不能抑制冰晶的生长 2．2．4胡萝卜抗冻蛋白的低温冻存保护实验 的，因而，找到一种能直接抑制冰晶生长的物质至关重 将重组DcAFP分别以梯度浓度和3％甘油混合作为 要。经过研究者的多年努力，发现了能与冰晶相互作用 抗冻剂，分别对大肠杆菌细胞和水稻悬浮单细胞进行 并控制冰晶生长的一类特殊物质——抗冻蛋白 化冻存实验【8】，同时进行阴