基于SSH的Bursaphelenchus+zylophilus和Bmucronatus基因差异表达分析研究.pdfVIP

农业与林业 26】 基于SSH的B比rs口p庇P比挖c庇Msxylophilus和 B．mucronatus基因差异表达分析① 黄麟叶建仁 南京林业大学森林资源与环境学院，江苏省南京市，210037 摘 要 个EST序列，拼接后获得147和146个独立基因，并用定量PCR进行了初步的功能验证。独 立基因的注释结果表明，ANl9#F1一l和AN5#F7—1在致病性相关基因以及病程相关蛋 白的表达上存在明显差异，这将为探讨两者的致病差异的分子机制奠定基础，同时获得部分 EST也将有助于构建两者进化树的中间标记，揭示二者在系统发育等方面的关系。 关键词 森林保护学松材线虫痛 致病机制 抑制消减杂交(SSH) 通过比较特征性状不同的生物基因组的差异，分离物种之间的差异序列，可以阐明与某些特性相关 的分子机制。如毒性、疾病等，作为检测某种生物的分子标记，和用于构建进化树的中间标记，发现物种 进化中潜在的联系。抑制消减杂交作为一种分离差异表达基因的新方法，克服了以往任何一种消减方 法的技术限制，使不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆。SSH自1996年报道以来，由于其试验 方法的优越性，被迅速应用于疾病相关基因克隆，取得了较大进展，并与其他的技术相结合，如DNA芯 片技术相结合，克隆了许多相关的差异表达基因。在克隆同属不同种的真核生物差异表达基因方面， Eric等利用SSH技术构建了近缘物种Globoderapallida和G．’mexicana’的消减文库。 极为密切的亲缘关系，同时在形态、生物学习性、生理代谢、寄主选择性、区域分布等方面都非常相似。 但两者在对部分松属植物上的致病性则分化明显，关于探讨造成两者致病性分化的机制方面，目前大量 的研究都集中在二者种间、种内的致病分化，以及致病性的地域分化和细菌等外部因素对该病发生、发展 的影响，而未能很好地阐明该病的致病机理，而且都没能从两者的致病基因的表达水平上的差异来揭示该 病可能的分子机制。本研究采用抑制消减技术构建了松材线虫和拟松材线虫的正反消减基因文库，比较 两者基因表达差异，为深入开展两者的系统发育、进化关系以及松材线虫的致病机制等研究奠定基础。 一、材料与方法 (一)材料 1．线虫材料 cinerea)的培养基上扩繁，线虫收集后经0．2％ (B．mucronatus)(AN5#F7—1)在长满灰葡萄孢(Botrytis ① 基金项目；国家自然科学基金资助项目，江苏省高等学校研究生创新计划(2005～2007)。 262 第五届博士生学术年会论文集 的硫酸链霉素消毒30min，灭菌生理盐水洗涤3遍，将经表面消毒后的线虫置于新鲜的灰葡萄孢(B．ci一 留的灰葡萄孢菌丝，洗涤后的线虫液氮速冻后，一80℃保存备用。 2．主要仪器、试剂 mRNAmini RtaseeDNA Kit kit(Qiagen)；M-MLV 试剂：Trizol(Invitrogen)；Oligotex Synthesis (TAKARA)；PCR-SeleeteDNAsubtraction vector kit(Clontech)；pGEM—Tsystem(Promega)；酶类、 dNTP、MARKER等购自TAKARA、TIANGEN。 PCR System(ABI)；凝胶成像系统(Bio．RAD)等。 仪器：GeneAmp (二)方法 1．AN5#、ANl9#mRNA纯化及双链eDNA的合成 mRNAmini 利用TRIzol试剂提取线虫的总RNA，OligotexKit纯化mRNA，操作均按使用说明