荧光定量原理与应用(第三版).ppt

SYBR Green I Melt Curve Analysis Melt Curve Analysis Melt Curve Analysis SYBR Green I 优点 使用方便 --- 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 --- 可以用于不同的模板 便宜 灵敏 SYBR Green I 缺点 与非特异性产物结合 提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析 实时荧光定量PCR技术简介： 多重PCR 在一个PCR管中进行多个不同的PCR反应： 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因 内参照基因（看家基因） 不同荧光标记的探针识别不同的靶基因 多重PCR的好处： 减少初始模板用量 减少试剂消耗、增加实验通量 内参照基因 解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别 内参照基因 多通道技术 多通道技术： 使用多种荧光染料 在不同的检测通道内同时测定多种不同 荧光染料发出的荧光 1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰 2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行 2、模板量差别---共用资源的相互竞争 多重PCR技术问题 一个PCR管内进行多重PCR扩增要解决的问题： 提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析 实时荧光定量PCR技术简介： 绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相对标准曲线 不使用标准曲线，利用Ct值计算 ΔCt方法 ΔΔCt方法（看家基因） Pfaffl方法（考虑扩增效率） Vandesompele方法（多看家基因） 14500 copies 定量方法 利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响 使用标准曲线法进行相对定量分析 相对定量——标准曲线法 表达差异 基因表达差异分析（替代Northern Blot)： responses to a particular stimulus tissue differentiation stages of development cell proliferation disease state progression 研究方面部分应用 材料和方法 50oC,30min 95oC,15min 94oC,15sec 60oC,1min plate read go to step 3,39 more times 10oC,forever End 提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 熔解曲线分析 基因分型（SNP）检测 实时荧光定量PCR技术简介： Temperature increases Fluorescence decreases Tm Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curve SYBR Green I 融解曲线分析 荧光强度的倒数取负数后对温度作图(-dI/dT) -dI dT Tm SYBR Green I 融解曲线分析 溶解曲线的作用 溶解曲线分析的主要作用 预实验中用于判定产物的纯度 是否存在引物二聚体和非特异性产物 预实验中结合温度梯度功能用于 判定最佳退火温度 基因分型或SNP 产物特异性分析 10,000 copies 非特异性产物 目的产物 目的产物 10 copies 10,000 copies 10 copies 0 copies 溶解曲线 扩增曲线 1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1