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实验四 植物病原细菌及所致病害观察 一、概述： 植物细菌病害的野外及室内的诊断鉴定，是对植物细菌病害最基本实践之一。在未经诊断确定其为细菌病害之前，许多深入的工作将无从进行。 植物细菌害的病状以组织坏死类型的病状较为普遍常见，少数下也可由于细菌寄生于输导组织而造成萎蔫，由于增生或抑制引起的畸形则为数更少。植物薄壁组织被害后常表现为水渍状半透明的局部性斑点，其后颜色常加深为褐或黑色而枯死。叶部病斑的发展常受叶脉的限制和影响，成为多角形状。在输水组织中定殖和扩展的细胞，常使叶脉、输导组织变为黑褐色。在增生而致畸形的病害中，则罕有水渍状、变色、组织坏死等表现。局部性的细菌病状在高湿条件下及雨后较为明显，故在实验室内常用保湿方法以诊断细菌病害，绝大多数的细菌病害，都可向病部表面泌出含大量细菌个体的液滴，称为“溢脓”病症，是植物细菌病害的诊断特征。一些病组织内细菌数量很少的细菌病害，以及在湿度不足时，许多细菌病害都很难表现出溢脓病症，为此需进行室内显微镜检验以察明在病组织是否有细菌的存在，才能作出准确的诊断。 二、实验目的： 1．认识植物细菌病害的症状类型及特点。 2．学习植物病体病原细菌的显微镜检验。 三、实验材料及准备： 棉花角斑病 Xanthomonas malvscearium 核桃黑斑病 X . jangladium 柑桔溃疡病 Xanthomonas citri 桑烂头病 Pseudomonas mori 女贞叶斑病 Pseudomonas ligustri 十字共科软腐病 Pseudomona solanacearum 杨树根癌病 Agrobacterium tumefaciens 灭菌水、小剪刀、刀片、尖口镊子、载下片、纱布等各组准备一套。 四、实验方法及步骤： 1．症状诊断 ①观察供给的腊叶标本及新鲜的病害标本，注意各个病害表现的具体特点和它们的共同特点。 ②有无“溢脓”病症，呈何种表现状态？ 2．显微镜检验 对病症不显著的细菌病害，或是经病状诊断不能确诊的病害，须经显微镜检验，以检视病组织中有无细菌的存在。因为极少数细菌病害，除根癌病等外，绝大多数的植物细菌病害的病组织中均有多数细菌个体，解剖检验时可以见到细菌大量的从病组织中涌出。据此，可以确定为细菌性病害。在操作时应，除以下诸点： ① 病组织中腐生的细菌：许多植物病害在寄组织死亡之后，常可有腐生细菌发生。为排除此种可能，应当选择新发生的病斑，或是剪取病斑边缘的组织进行检验。 ② 病害组织表面污染物排除。病害组织表面常沾染其它的微生物，因此，应在流水下仔细冲洗经过上述初选的带病斑的小寄生组织。 ③ 器械及用具的污染：所用器械，如刀片、剪刀、玻片、镊子等物，要经过70%酒精棉球擦洗。 在上述准备工作完成后，按下列方法进行镜检： ①取载玻片，仔细以纱布擦净，在灯焰上灼烧灭菌，待凉；取经过选择及冲洗的病组织块，在玻片上用刀片取病健相间的组织；约为5毫米大的方块。 ②材料放于另一玻片上，用刀片通过病斑切成数块，然后在玻片上滴1%蛋白胨液一大滴，加盖玻片覆盖，补足或吸去多余的水，无1%蛋白胨液时，一般灭菌水，或过滤的凉开水亦可。 ③在显微镜下检视病组织的切面，光线要适中，不宜太强，放大倍数在100-300倍时较适宜，注意在患病组织的切面上，寻找自组织中涌出的细菌群体，如云雾状徐徐排出。 ④为证明观察无误，用健康组织按同样方法作镜检为反证。 镜检步骤③所观察的玻片，如须观察菌体的形态，可以经干燥固定后供作染色观察。 五、实验作业 ①对供观察的各类植物细菌病的症状分别进行拟述。 ②根据柯赫氏准则，说明症状诊断及病体显微镜检验的意义。附录 细菌的革兰氏染色和鞭毛染色 本实验只做与病原鉴定有关的革兰氏染色和鞭毛染色。其它如菌体、芽孢、荚膜、抗酸等染色方法，可参阅《植物病理研究方法》或其它参考书。 1．革兰氏染色 革兰氏染色反应是细菌的一个重要特性，细菌可分为革兰氏阳性（+）和阴性（-）两个类群，植物病原细菌中除棒状杆菌属（Corynebacterium）外，其它各属均为阴性。 ①染色剂的制备： A．草酸铵结晶紫 甲液：结晶紫 2克 乙醇（95%）20毫升 乙液：草酸远 0.8克 蒸馏水 80毫升 混合甲乙两液，可长期保存 B．碘液 碘1.0克 克蒸馏水300毫升 碘化钾 2.0 C．番红1%水溶液或稀释齐氏品红液 ②玻片的洗涤： 制备细菌涂片时，必须用无酯的载玻片，清洗方法如下： 载玻片浸于稀盐酸溶液中，取出凉干并以脱酯纱布擦洗。 清水冲洗干净，以优质去污粉调成糊状，仔细地擦抹每一玻片及其边缘。不经冲洗放在玻片架上摊上凉干。 使用前，用脱脂纱布擦去玻片表面的去污粉，勿使粉屑残留在玻片上。玻片保存在防尘的容器内，备用。 ③涂片： 取一般载玻片，如蒸馏水