生物制药工艺学课件PPT.ppt

第三节 生物技术药物制造技术基础Basisof biotech drug pharmaceutical technolog 一、基因工程制药技术基础 （一）重组DNA技术基本原理 基因工程是通过体外重组将甲生物基因转入乙受体生物内进行表达的生物技术，包括6个主要过程： （1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体； （3）将重组体导入宿主细胞； （4）目的基因的克隆与鉴定； （5）目的基因的扩增与目的蛋白的表达。 （6）目的蛋白的纯化与制剂 ?2．基因工程药物制造过程 转化 获得目的基因→构建重组体 → 构建工程菌（或细胞）→克隆与鉴定 Up stream →扩大工程菌培养（或细胞）→纯化目的蛋白→除菌过滤→半成品检定 →制剂→成品检定→包装  Down stream 二、基因工程制药主要操作技术 （二）基因工程制药操作技术 1．目的基因的获得 （1）逆转录法：真核基因转录的hmRNA在原核不能直接表达（隐含有内函子），在原核中缺乏hmRNA后加工系统，故不能成为成熟的hmRNA,故要先纯化目的mRNA，再通过逆转录作用下合成SSDNA(Sigle stran DNA)。 ①cDNA第一链的合成:以目的mRNA为模板（3’-poly…AAA）,以oliger-dT为引物，加入dNTP, 在逆转录酶作用下合成SSDNA(Sigle stran DNA). ②cDNA第二链的合成:先用碱或RNaseH水解除去与SSDNA配对的mRNA得到cDNA第一链，作为合成cDNA第二链的模板，在DNA聚合Ⅰ（klenow片断）作用下，加入dNTP,从5’→3’合成带有发夹结构的U型DNA，以核酸酶S1切除U型结构，形成双链DNA dsDNA(cDNA)。 图5 目的基因的获得 （2）通过PCR技术制备目的基因 PCR（polymerose chain reaction）典型反应包括 ①模板变性 94℃以上（1～2′）(使DNA拆为单链) ②退火 50～55℃（1～2′）(使引物与模板配对) ③延伸 72℃（1～2′） 由高温聚合酶催化从5’→3’延伸链长。一般可通过30次循环，合成一定量cDNA,错误率一般为0.25%。(扩增105倍) 已有高温DNA聚合酶，故操作已自动化（PCR仪） （3）化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。 2．DNA重组体的构建 将目的基因与基因载体连接，构成重组体 基因载体（Vector）有 （1）E.coli载体 如PBR322（非表达型载体） 表达型：PUC质粒，PKK233-3，P ET系统：PET28a，PET32 （2）芽孢杆菌载体 如PUB110 pE194和pC194 （3）链霉菌载体 如PIJ101 PSG5 （4）λ噬菌体载体 如λgt10(非表达型) λgt11(表达型) *非表达型用于构建克隆基因扩增与鉴定， 表达型用于构建生产目的蛋白的工程菌。 一般目的基因10Kb，可选用质粒为基因载体， 目的基因10Kb，可选用λ噬菌体DNA为载体。 cDNA与载体连接方法同聚尾连接法用3’-脱氧核苷末端转移酶，使cDNA与载体DNA3’末端带上互补同型多聚体序列：如质粒-poly-C（或A）cDNA-poly-G(或T) 两者退火后，经T4DNA连接酶封口，构建重组体。 3’脱氧核苷转移酶 cDNA cDNA-polyA(C ) dNTP 载体DNA-polyT(G) ②人工接头连接法 用T4DNA连接酶在平端上连接上人工接头，再用工具酶切开成粘性末端。 目的基因 + cDNA 接头 工具酶（内限性内切酶） 3．重组体的表达系统 表达方式常用有①胞浆内表达 ②分泌表达 ③周质表达 （1）原核表达系统 ①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces E.coli表达系统的优点：①易大量生产，成本低，②周期短，相对较安全，已公认可供大量生产。