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基因水平传递在复合微生物培养中的应用研究
— 阳离子表面活性剂对Pseudomonasputidamt-2(TOL)
的高分子物质通透性影响初步研究
厉鹅 邢新会
(清华大学化学工程系生物化工研究所)
1 前盲:
当前在遗传工程、细胞工程和基因工程方面,基因转移的研究越来越多地受到人们的关注。
尤其在多种类徽生物的复合培养中,可以通过细胞之间的基因水平传递达到不同功能的微生物
复合培养的目的。例如在环境保护等领域中,对复杂难降解有机物的微生物处理已经成为非常
重要的治理污染的方法之一,而开发难降解有机物的高效分解技术的关键在于提高处理体系的
微生物多样性。实现这一目的方法之一是将已知特殊降解物分解菌引人污染处理系统,并使其
分解能传播于不同种类的微生物,从而使多种微生物都获得分解污染物的能力。
P.putid。细胞内含有高效分解苯,甲苯,二甲苯等有机物的TOL质粒 (115k6),所以如果能
够将TOL质粒导出细胞外,水平传递到异种细菌细胞内并表达,将会增强异种细菌降解甲苯的
能力,这在难降解有机废水处理等环境修复方面具有重大的意义。但由于实验体系的复杂性,
目前这方面研究很少。本研究目的在于通过加人阳离子表面活性剂,利用其与细胞表面的结合
来改变细胞膜结构,从而改变细胞对大分子物质的通透性,使TOL质粒的人为析出成为可能,
同时确立使TOL质粒水平传递进人其它细胞的方法。实验所用阳离子表面活性剂是十二烷基三
甲基澳化按 (DTAB)。前期实验证明,它可与P.putida的细胞表面进行作用,有效地将其控制于
休眠状态。为验证DTAB对细胞膜的高分子物质通透性的影响,选用异硫氢酸荧光素一右旋糖昔
(FD)作为检验试剂。其分子量足够大,正常情况下很难以进人细胞内,可通过测定荧光强度探
讨细胞膜通透性变化。生物学中常用FD作为向细胞内导基因的模拟高分子物质。为探讨DTAB
对P.putidamt-2细胞的高分子物质通透性影响,本实验针对以下内容进行了研究:1)分析
DTAB的加人对细菌增殖产生的影响;2)分析荧光素FD分子量大小和DTAB的加人对细胞的ED
通透性产生的影响。
2 实验材料与方法:
本研究中所用培养基组成为TryptonelOg/L,Yeastextract5g/L,NaCllOg/L(LB培养基)。实
验所用细菌均经过Ovemight培养。所有细菌培养均是在29C,100rpm的摇床上进行的。本实验
使用的FD分子量为4000,10000,20000,40000,FD均经过高温灭菌处理后使用。
2.1DTAB加入对细菌增技和细胞外蛋白浓度的影响
分别于细菌开始培养后0,3,9,14小时加人DTAB,探讨DTAB对细菌增殖的影响。同时
测定细菌培养3小时后加人DTAB前后胞外蛋白浓度变化。用不加DTAB的细菌培养实验作对
比。若不做特殊说明,DTAB加人培养液的浓度均为1以Lo
2.2 DTAB处理细胞的FD通透性变化
在细菌培养3小时后加入DTAB的情况下,分别使用上述四种不同分子量的FD,测定细胞
外的FD浓度随时间变化,进而分析FD分子量对细胞的FD通透性的影响。选定FD一20为基准,
解析FD的细胞内传递过程。在细菌培养3小时后加人DTAB,测定细胞外FD一20浓度随时间变
化。同时进行不加DTAB、只加人FD一20和培养开始第0时刻加人DTAB、之后再加人FD一20
的对比实验。
200
2.3 分析方法
细菌浓度用波长660nm光学密度 (OI场〕)进行测定;蛋白质浓度测定方法为Bi。一RadPro-
teinAssay标准方法;FD浓度测定是通过FD荧光强度一Fl)浓度标准曲线由测定其荧光强度得
到。
3 结果与讨论:
3.1DTAB加入对细菌增殖和细胞外蛋白浓度
的影响 仙 -.--田礴
一.一FBlM
不同培养时间添加DTAB实验结果表明, 仙 }-- DF 21s
DTAB的加人可以使细菌增殖马上停止,进人
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