外源性P21WAF1CIP1基因治疗脑胶质瘤的实验研讨.pdfVIP

厦门市科学技术协会第四届青年学术年会论文集 外源性P21wAFl／CIPl基因治疗脑胶质瘤的实验研究 王占祥。，方耀春，姜月明，潭国伟，朱宏伟 陈四方，章 翔，费 舟，张剑宁，付洛安 (厦门市第一医院，解放军神经外科研究所) 摘要：目的：探讨外源性P21咖7删基因对胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响。方法：采用脂质体介导法将P21Wan／cln基 因质粒转导入人胶质瘤细胞系SHG44胞，然后用电镜、流式细胞仪等技术对细胞形态、生长及细胞周期进行观察。结果： 生；生长速度明显慢于亲代细胞，其倍增时间约是对照细胞的二倍；细胞周期发生明显改变，G1期明显增多。S期明显减少。 结论：外源性P21wan7an基因对SHG44fiH胞的生长和细胞周期有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡产生。 关键词：P21w^n7c1P1基因；肢质瘤；细胞周期；凋亡 随着对癌基因、抑癌基因以及它们与肿瘤发生、发展关系研究的不断深入，越来越多的人们认为肿瘤 是一种基因改变性疾病。肿瘤的发生往往与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，因此基因治疗可能最 终成为根治肿瘤的有效途径之一…1。本研究应用逆转录病毒真核表达载体，将抑癌基因P21wAll／CIPI全长 期的影响，为其进一步临床应用研究奠定基础。 l材料与方法 I．1主要实验材料 限制性内切酶(NotI，EcoRI，Xho TM reagent)由GibcoBRL公司提供，潮霉素由德国宝灵曼公司提供。人SHG44胶质瘤细胞系由苏州医学院脑肿 瘤研究所提供。 1．2主要实验方法 1．2．1 P21WAFl7c口1基因转染SHG44细胞 (1)质粒的转化、扩增、提取及鉴定：按《分子克隆实验指南》进行。 X 物；Q2105对数生长期细胞接种于35mm培养皿中培养24h；③以无血清培养液洗涤细胞，加入脂质体复 于检测，另一部分细胞加入含潮霉素(2S0mg／Illl)的培养液筛选抗性细胞。 杂交：参考操作手册进行。 1．2．2转染P21WAn／C聃基因对SHG44细胞生长和细胞周期影响 (1)细胞形态观察：基因转染前后收集细胞，分别进行HE染色光镜和透射电镜观察。 ·作者简介：王占祥(1964．)，男．剐教授，副主任医师 通讯地址：厦门市第一医院神经外科．361003 ·296· 厦门市科学技术协会第四届青年学术年会论文集 孔培养板中，细胞数为2．5×103／孔，常规培养，每天倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，于接种后2、 4、6、8、10d各取3孑L细胞计数，取均数绘制细胞生长曲线。 心收集细胞沉淀，然后70％的冷乙醇固定细胞16h；②生理盐水洗涤细胞2次，调节细胞浓度为1×106个 q期，S期和G2期细胞各占百分比，并观察是否存在凋亡细胞及其所占比例。 1．2．3统计学处理 结果用f进行统计学分析。 2结果 2．1 P21WAn／cnn基因转染SHG44细胞 2．1．1 PCEP—P21WAn／C聃质粒的提取及鉴定软琼脂平皿上随机挑选氨苄抗性菌落，LB培养液中扩增， cDNA 碱裂解法提取质粒及纯化后，NotI酶切电泳可见2．1Kb和O．4Kb两条泳带，片段大小与P21WAn7c 和PCEP长度相吻合，用XhoI和EcoRI联合酶切后，得到长度为1．1Kb和11．3Kb两条泳带，说明该质粒 为正义连接PCEPP2l驯吼7c1P1。 2．1．2 浮，空泡变性，72h后出现细胞死亡，死亡细胞数量逐日增加，4—6d达高峰，但在大片死细胞中出现新生细 胞，呈多角形，逐13增多，在18。21d形成新生细胞克隆，呈现“细胞岛”状。亲代SHG44细胞加入潮霉素后 于一周内全部死亡，初步证明基因转染获得成功。 2．1．3斑点杂交检测结果以P21wAFI／ClPI 功地导入SHG44细胞中，并有mRNA的较高表达。 2．2转染P21wAFl7c1P1基因对SHGnn细胞生长和细胞周期影响 但可见部分凋亡细胞出现。 电镜下观察：部分细胞体积缩小，电子密度反差低，呈“暗细胞”状态，核膜完整，染色体碎裂，致密染色 体团块边集于核膜内侧，表现出明显的凋亡细胞形态。 细胞计数，然后以生长天数为横