大肠菌群测定方法的研讨.pdf

全国排水委员会2006年年会论文集 大肠菌群测定方法的研究 庞玉凯，陈星，刘娜 (天津市城市排水监测站，天津300221) l研究的意义 生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便所污染。水中含有细菌总数与水污 染状况有一定的关系，但是不能直接说明是否有病原微生物。所以根据水中大肠菌群的数日来判断 水源是否被粪便污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。 检查大肠菌群的方法主要是多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵使用历史较久，又称水的标准 分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性 好，又能测定大体积的水样。我们对这两种方法进行对比，探索出对不同水质适用的方法。 2实验原理 2．1多管发酵法 根据总大肠菌群应具有的生物特征，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37‘C24小时内能发酵乳糖并 产酸产气，能在选择性培养基上产生典犁菌落。 2．2滤膜法 滤膜是一种微孔薄膜，孔径0．45一O．65 gm，能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜 上，然后将滤膜贴在选择件培养基上，经培养后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，算出 每升水样中含有的总大肠菌群数。 采用两种方法同时对各种水质进行测定，从而比较出两种方法的优缺点及适用范围。 3实验器材 ①高压蒸气灭菌锅、干热灭菌箱、恒温箱、冰箱 ②47toni滤膜 ③抽滤器、泵 ④放大镜、显微镜 ⑤试管、平皿(直径9厘米)、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160C灭菌2小时 ⑥乳糖蛋白胨培养基 ⑦品红亚硫酸钠培养基 ⑧大肠埃希氏菌种(菌号44113) 4实验步骤 4．1滤膜法 ①滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15分钟。 前两次煮沸后需更换水洗涤2—3次，以除去残留溶剂。 ②滤器灭菌：用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。 -616- 庞玉凯，等：大肠菌群测定方法的研究 ③过滤水样：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放已灭菌的滤床上，稳妥 地固定好滤器。将合适量的水样注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在负0．5大气压下抽滤。 ④水样滤完后，再抽气约5秒钟，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子央取滤膜边缘部分， 移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者不得留有气 泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22—24小时。 ⑤观察结果：挑选符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。紫红色，具有会属光泽的菌落； 深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落； 凡革兰氏染色阴性无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液．经37C培养，前者24小时产酸产 气者：或后者经6～8小时培养后产气者，则判定为总大肠菌群阳性。 ⑥计算结果 4．2多管发酵法 ①将水样作1：10稀释 ②初发酵试验：于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入 10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，各加入lmL水样；于 各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，各加入1mL浓度1：10的稀释水样。 共计15管，三个稀释度，混匀后置于37(2恒温箱内培养24小时。 ③平板分离：经培养24小时后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培 养基上，再置于37C恒温箱内培养18～24小时，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进 行涂片、革兰氏染色、镜检。 ④复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分再 接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中(内有倒管)，每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落 l一3个，然后置于37。C恒温箱中培养24小时，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。 ⑤根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数查MPN表，即为每升水样中的总大肠菌群数。 5实验测定结果及分析 5．1对津河水、南大湖水、污水厂出水、纯净水的测定 ①对津河水、