微生物基因敲除技术的研究进展精选.pdfVIP

研究论文 微生物基因敲除技术的研究进展‘ 刘建密1’2邵铁梅2李国勋3宋福平2” (1河北农业大学植物保护学院，保定071001； 2中国农业科学院植物保护所、植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094； 3莱阳农学院，青岛266000) 摘要：随着微生物基因组学的发展，基因敲除技术在微生物基因功能方面的研究得到 广泛的应用。本文概述了基因敲除技术的概念，起源及原理，微生物基因敲除系统和微生物 基因敲除的技术要点，并对微生物基因敲除技术的应用情况作了简要的叙述。 关键词：基因敲除；同源重组；插入型载体；置换型载体 来，到2006年8月27日为止，已经完成了包括大肠杆菌、痢疾杆菌在内的413种微生物 全基因组序列的测定…。这些全基因组序列的测定为进一步研究各种微生物的基因功能 奠定了基础。研究基因功能的重要方法之一是构建基因的突变体来检测其表型的变化，以 推测该基因在生长过程中起到的作用。最直接的方法是将目的基因敲除，这样可以保证被 研究的基因功能完全失活。 下面就基因敲除技术的概念、起源及原理，微生物基因敲除系统，微生物基因敲除的 技术要点及应用情况进行了介绍。 1基因敲除的概念、起源及原理 1．1 基因敲除的概念 knock 基因敲除(gene out)，又称基因打靶，是同源重组技术的形象说法。它是指用 外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体 细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术【2J。此种技术的优点在于整合位点确 定、精确，转移基因频率较高，既可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状(一个 生物的任何可以鉴别的表型特征)的改良和遗传病的治疗，又可以用突变的基因敲除正 常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。基囚敲除技术在微生物方面的研究主 要集中在将正常的基因敲除以研究其功能方面。 1．2基因敲除的起源与原理 生物界同源重组现象的发现，为基因敲除技术奠定了坚实的理论基础。早在20世纪 初，Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交 ·基金项目：国家973项目：(2003CBll4201和2001CBl09005)资助 作者简介：刘建密，硕士研究生，从事抗生素ZwittermicinA生物合成相关基因的研究。 ··通讯作者：宋福平，Tel：010E．mail：fpsong@ippcaas．cn 科技创新与绿色植保 换的基础。同源重组(homologous 中相同或者相似DNA序列问的重组【lJ。基因的同源重组是较普遍的生物现象，其分子机 理尚未阐明，但活细胞内确有一酶系可使DNA的同源序列在细胞内发生重组，如大肠杆 XRCC3等。 关于同源重组的分子机制目前尚未阐明，但现在已相继提出了多种解释同源重组的模 毹释双链断裂可大大提高同源重组的效率这一现象H】。Lin等于1984年提出完全不同的 单链退火模型(SSA)，提供了理解同源重组机制的全新视角”j。此外，一些学者还提出 了其他的同源重组模型，如三链DNA模型、RNA介导重组模型等№刊。随着研究的深入 对同源重组的机制会有更合理的解释。 2微生物基因敲除系统 打靶系统、Chi位点刺激的重组、利用单链DNA进行的重组工程、转座子突变系统p。； 在酵母中最常用的基因打靶技术包括两类，一类是转座子标记的突变系统，另一类是 统、噬茵体退火蛋白介导的寡核苷酸重组系统；其他微生物中进行基因打靶的系统有：转 座子突变系统、自杀载体策略等¨“。 3微生物基因敲除的技术要点 微生物基因敲除的技术要点如下：①基因敲除载体的构建：将与靶序列同源的序列重 组到带标记基因的载体上；②打靶载体的导人：在微生物中，一般用电穿孔方法将打靶载 体导人受体细胞内；③同源重组子的筛选；④突变体的形态观察和分子生物学鉴定。 3．1 基因敲除载体的构建 基因敲除载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源 序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体的同源重组序列～般先通 过特异性探针从基因组DNA文库中分离得到的含有目标基因(靶基因)的克隆后，选取 适