商品肉鸭鸭瘟病毒的分离与鉴定研究.pdf

其它病毒病 商品肉鸭鸭瘟病毒的分离与鉴定 王洪海1胡薛英2苏敬良”何双辉1程永友1郭玉璞1 (1中国农业大学动物医学院北京100094#2华中农业大学畜牧兽医学院武汉430070) [摘要] 囊和脑组织等制备石蜡包埋切片，利用单抗进行免疫组化检测，除脑组织外均得到阳性结果。 列同源性达到99．73％。 [关麓词]鸭肠炎病毒；单克隆抗体；免疫荧光；聚合酶链式反应(PCR)；检测 virus 鸭病毒性肠炎(Duck enteritis，DVE)，又名鸭瘟(Duckplague)，在我国有些地方俗称“大头瘟”，是鸭、 鹅及多种雁形目动物的一种急性、高致死率的传染病口]。该病以前在我国广大养鸭地区主要为散在发生，而且多 见于成年种鸭和蛋鸭。近年来，随着商品肉鸭集约化饲养范围的不断扩大，该病在商品鸭群中的发病呈明显上升 趋势，未免疫鸭群的死亡率接近100％，而且在同一地区或同一鸭场的不同日龄鸭群间迅速扩散，给养鸭业造成 离毒和三株弱毒的DNA进行扩增，结果均呈阳性，而其他六种鸭病病原扩增结果呈阴性。郭宵峰等“3同样对鸭 瘟病毒核酸进行PCR检测，结果良好。本研究对山东和北京2个鸭场发生的鸭瘟进行了病原的分离，采用单抗问 接免疫荧光抗体技术和PCR技术进行了鉴定，同时进行了人工感染试验和病毒抗原的免疫组化检测，结果证明 所分离的病毒为鸭瘟强毒。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1抗鸭肠炎病毒单克隆抗体本室制备和保存 1．1．2 FITC标记羊抗鼠IgG及HRP标记羊抗鼠IgG进口分装 1．1．3北京鸭胚和雏鸭购自中国农业科学院畜牧所 1．1．4鸭瘟标准毒购自中国兽医药品监察所 1．2方法 典型的鸭瘟病变。 按1：1加入双抗混匀，4℃过夜，再以220nm微孔滤膜过滤后作为接种材料。 *通讯作者：E—mail：sujing]【@cau．edu—c“ 一725 生垦堕墼量匿堂垒煎瘟堂佥盒塑±三丛三塞查受堕垒鲨塞塞 好的DEF上，加1％小牛血清维持液，37 c培养观察细胞病变情况。待细胞出现明显病变对，收集细胞培养物冻 融，并继续在DEF上传至第三代，然后进行鉴定。 细胞培养液，0．Stall只；第三组按照同样方法接种DEV标准株。 1．2．4单克隆抗体间接免疫荧光检测 细胞单层，然后加入少量0．25％的胰酶消化细胞单层，当细胞变圆、间隙明显扩大时，弃胰酶，加入PBS轻轻冲洗 并吹打分散细胞，细胞悬液经1 取细胞悬液滴加道载玻片第一排样品格(10埘／格)，第二排样品格滴加未感染病毒的正常DEF作为对照。自然干 燥后，于冷丙酮中同定10分钟。 时振荡，最后用蒸馏水漂洗5min，风干．于荧光显微镜下观察。 1．2．5试验感染鸭组织中病毒抗原的检测取试验攻毒组濒死期鸭只，分别采集胰腺、肝脏、法氏囊和脑等组织， 色程度，及时终止；流水洗3分钟，苏木素衬染，盐酸、乙醇分化，水洗蓝化，常规树脂封片，镜检。 1．2．4PCR检测 1．2．4．1 PCR检测方法的初步建立 PCR引物的设计与合成根据GenBank上发表的DEV序列，利用Primer GATTCTTTTC 数为76513p，该片断的在DEV基因组中的位置和功能目前尚不清楚。上游引物：5’GTCGAC GTCGACGAATTCGTTA GcGTATT3’，下游：5’GC TGTAA3’。目的片段2碱基数为1 TAGGC GTCGACAGCTTCTTTT UL7片段，上游引物：5’GTCGA(：AGCTTGCTCAA3’，下游：5’C DNA 10xReaction dNTPs(2．5mM)5m，MgCl2(25raM)5出，Taqpolymerase DNA 游引物(