导入额外拷贝nifA基因的大豆根瘤菌工程菌株的构建.pdfVIP

第27卷第6期 黑龙江大学自然科学学报 V01．27No．6 JOURNALOFNATURALSCIENCEOF UNIVERSITY 2010年12月 HEILONGJIANG December，2010 导入额外拷贝n弘基因的大豆根瘤茵工程 菌株的构建 李海英， 张喜波， 刘金玲， 于海鹏， 杨 乐， 蒙明明， 贾珊珊 (黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨150080) 技术，克隆固氮基因n／fa全长；将其连入带有lac启动子下游，构建带有LuxAB基因标记的表达载 体pTRl02，采用三亲本杂交技术转化土著大豆根瘤茵中，构建大豆根瘤茵工程菌株。为研究转基 因工程菌株对大豆固氮能力的影响奠定基础。 关键词：大豆根瘤茵；n泓基因；三亲本杂交；大豆根瘤菌工程菌株 中图分类号：s566．3；S188文献标志码：A 0 引 言 氮是构成蛋白质和核酸的主要物质，是农业生产中必不可少的生物肥料。生物界氮素输入的最主要物 质形式是大自然含量极低的氨态氮，其供应成为生物界繁荣发展的主要决定因素。氨态氮的来源主要通过 固氮作用。固氮作用有两种，即生物固氮和非生物固氮。全球范围内每年输入陆地生态系统的总氮量约在 两亿吨左右，而三分之二是来自生物同氮¨一J。近年来的工作指出，固氮基因n弘具有多效性，其产物NifA 蛋白具有ATP酶活性，是转录的正调节产物，直接催化n／f基冈和．肛基因的表达，并诱导宿主防卫反应基因 的表达，因此成为生物固氮过程的核心因子b’8J。因此，目前通过DNA重组技术来额外加强nifA基因的表 达水平是提高根瘤菌的固氮效率和结瘤能力的途径之一【9—0|。 建大豆根瘤菌转基因工程菌株。为研究转基因工程菌株对大豆同氮能力的影响奠定基础。 1 材料和方法 1．1供试菌株 1．2质粒载体 1．3履泓基因的克隆 Vector Easy 收稿日期：2010—10—16 基金项目：黑龙江省科技攻关项目(GA088101)；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目(RC2009XK001004) 作者简介：李海英(1968一)，女，教授，博士，博士生导师，主要研究方向：植物分子生态学，E．mail：lvzh3000@sina．eom 第6期 李海英等：导入额外拷贝n／fA基因的大豆根瘤茵工程菌株的构建 ·745· PCR方法进行签定，将阳性克隆送至上海博亚公司测序。 1．4表达载体pTR—PIlc一哟『：4的构建 1．5大豆根瘤菌基因工程菌株的构建 P。。。一nifA上含有发光酶基因luxAB，利用癸醛对培养的平板中的大豆根瘤菌转移接合子进行发光性检测，并 用x光片进行结果记录。 2结果与分析 2．1丹弘基因的克隆及分析结果 以快生型大豆根瘤菌15067的基因组DNA为 模板，采有同源序列克隆法，PCR扩增n／fA基因全 长，经检测后结果如图1所示。分别获得约1700 bp 特异条带，测序后与预期结果相一致。 利用NCBI网站中的BLASTn程序对测序获得 n／fa基因核苷酸序列进行在线分析，结果如图2(a) MarkerDL2 M：DNA 000；1：PCR扩增n泓基因的全长 和2(b)所示。所获得的n／fa序列与NCBI数据库中 图1 PCR扩增基因的全长 已收录的Rhizobium sp．NGR234aplasmid的见／fA基 PCR ng·1 amPu明6。nproductsofn