Southern Blot操作流程.docVIP

Southern Blot 操作流程 1、哺乳动物基因组DNA的提取（或用OMEGA试剂盒E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit） 取约30mg样品，加入600 ul SNET，再加入12 ul（20.2mg/ml）的蛋白酶 K，使蛋白酶K的终浓度为400ug/ml； 55℃振荡过夜； 加入0.6 ul RNaseA，室温下孵育10 min，后置于65℃ 10 min； 加入300 ul Tris饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul异戊醇，室温下振荡30 min； 17,000 g离心5min，转移上层水相（600 ul）至一新的离心管； 加入等体积（600 ul）的异丙醇沉淀DNA，于4℃下13,250 g离心15 min； 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min后除去乙醇，室温下干 燥15~20 min； 加入100 ul TE，使核酸沉淀溶解。 酶切 拷贝数的计算 哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下： 酶切体系 基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total 100 ul 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应； 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE洗脱； 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB）； 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min，以除尽残留乙醇和消除 酶切后产生的粘性末端； 电泳：1v/cm。 转膜 碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次； 中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次； 倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min； 转膜： 在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿； 放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生 气泡； 将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟； 小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡； 往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC； 再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸； 用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物 体压在吸水纸上面； 转膜过夜； 固定 将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中， 以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。 杂交 标记探针：可用随机引物法或PCR方法标记探针； 将尼龙膜有DNA 的一面朝内，卷成筒状放入杂交管中，加入10 ml 经预热 至50℃的DIG Easy Hyb，于50℃ 预杂交30 min； 取10 ul经标记的探针，热水浴5 min变性，然后迅速放入冰水混合物中； 将变性后的探针加入4 ml预热的 DIG Easy Hyb中，混匀，并防止气泡的产 生（气泡会产生背景）； 倒出预杂交液，加入含探针的杂交液，杂交4h或过夜。 杂交温度的计算 Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）[I=length of hybrid in base pairs] Topt= Tm-20 to 25℃ 洗膜 室温下用W1洗液洗5min，重复一次； 68℃下用W2洗液洗15min，重复一次； 将膜用 Washing Buffer浸润5min； 25~50℃下，用100ml Blocking Solution孵育30min，保持摇动； 25~50℃下，用20ml Antibody Solution孵育30min，保持摇动； 用100ml Washing Buffer洗15min，重复一次； 用20ml Detection Buffer平衡5min； 将膜放入杂交袋中，使含DNA面朝上，滴加1ml CSPD ready-to-use，将杂 交袋合上，并赶走气泡，于15~25℃孵育5min； 挤出多余的液体，将潮湿的膜置于37℃孵育10min，以增强发光反应。 显影 直接用成像系统成像。 DNA提取的溶液配制 1.Tris-HCl (1mol/L ；PH 8.0) 用800ml蒸馏水溶解12.1g Tris碱，加浓HCl（约42ml）调PH至8.0，应使溶液冷却至室温后，方可最后调定PH值，加水定容至1L。高压灭菌。 ***如果溶液出现黄色，应予以丢弃，并使用质量更好的Tris。 2.EDTA（0.5 mol/L ；PH 8.0） 186.1 g EDTA·Na·2H2O加入800ml水中，用NaOH调节PH至8.0（约需20gNaOH），定容至1L，高压灭菌。 ***EDTA·Na需在PH接近8.0时才会溶解。 3.NaCl (5 mo