一种快速高效的全基因组甲基化CpG岛富集方法的建立-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（５）：７８～８２ 一种快速高效的全基因组甲基化 ＣｐＧ岛富集方法的建立 １，２ １ １ １ ２ １ 周贝贝 　李明辉　于雅晴　宋　娟　陈　光　肖华胜 （１上海生物芯片有限公司／生物芯片上海国家工程研究中心　上海　２０１２０３　２吉林农业大学生命科学学院　长春　１３０１１８） 摘要　高甲基化的ＣｐＧ岛所致基因表观遗传学转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重要内容， 但尚未建立一种能快速在全基因组水平上进行甲基化ＣｐＧ岛的富集方法。利用甲基化结合蛋白 ＭＢＤ２ｂ具有特异性结合甲基化ＤＮＡ的特性，建立了一种基于ＤＮＡ免疫共沉淀技术的全基因组甲基化 ＣｐＧ岛的富集方法。在大肠杆菌中表达重组的ＧＳＴＭＢＤ２ｂ蛋白，通过ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ对重组 ? 蛋白进行纯化，制备成亲和层析柱，利用在不同的盐离子强度下甲基化ＤＮＡ和非甲基化ＤＮＡ的结合能 力不同，对甲基化ＤＮＡ进行富集。用甲基化酶ＳｓｓＩ处理过的ＤＮＡ片段与非甲基化ＤＮＡ片段进行富条 件的摸索，发现０．５ｍｏｌ／ＬＫＣｌ的浓度是甲基化ＤＮＡ片段和非甲基化ＤＮＡ片段得以分开的临界条件。 样品的富集效率用ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ进行检测。结果表明，这种方法能够实现对全基因组甲基化ＤＮＡ的 有效富集且最高的富集倍数可达到１００多倍。富集到的甲基化ＤＮＡ可以进行后续的定量ＰＣＲ，ＤＮＡ 测序和全基因组芯片的分析等工作，为大规模分析全基因组ＣｐＧ岛甲基化的改变奠定了基础。 关键词　甲基化ＤＮＡ　ＣｐＧ岛　ＭＢＤ２ｂ蛋白　亲和层析 中图分类号　Ｑ７８９ 　　ＤＮＡ甲基化是指ＤＮＡ在甲基转移酶（ＤＮＡｍｅｔｈｙｌ 物中存在一类蛋白———甲基化 ＣｐＧ结合结构域蛋白， ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＤＮＭＴ）催化下，将 Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳＡＭ） 能够结合甲基化 ＣｐＧ并参与基因转录抑制，在肿瘤发 ? ? 提供的甲基转移给ＣＧ二核苷酸的胞嘧啶，形成５甲基 ? 生中起重要作用。这类蛋白家族在哺乳动物中已被鉴 ［１，２］ ［５～７］ 胞嘧啶 。在真核生物 ＤＮＡ中，５甲基胞嘧啶是唯 ? 定的有５种：ＭｅＣＰ，ＭＢＤ１，ＭＢＤ２，ＭＢＤ３，ＭＢＤ４ ， 一存在的一种酶化学修饰性碱基。ＣＧ二核苷酸又是 其中ＭＢＤ２ｂ蛋白对甲基化ＣｐＧ岛的特异性结合最强。 最主要的甲基化位点，它在基因组中分布不均匀， 　　最近１０年内出现了很多甲基化ＣｐＧ岛检测技术， ［３］ ＧａｎｄｉｎｅｒＧａｒｄｅｎ和 Ｆｒｏｍｍｅｒ 首先提出将长度大于 ? 主要有基于甲基化敏感的限制性内切酶酶切或通过 ２００ｂｐ，实际与预期ＣＧ频率大于０．６的ＣｐＧ富集区，称 ＮａＨＳＯ（ｓｏｄｉｕｍｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）修饰，将 ＣｐＧ岛的甲基化信 ３ 为ＣｐＧ岛（ＣｐＧｉｓｌａｎｄ）。ＣｐＧ岛大多位于启动子和第 息转化为序列差异加以检测。限制性核酸酶法分析 一外显子，极少部分靠近基因的３′端，是基因具有活性 ＣｐＧ岛甲基化，受酶的敏感性影响。且不能够很好的 ［４］ 的标记 。已有的研究表明，ＣｐＧ岛甲基化与基因沉 反映整个ＣｐＧ岛的甲基化情况。亚硫酸盐