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教案临床基因扩增检验操作规范
临床基因扩增检验操作规范 浙 江 省 基 因 诊 断 中 心 浙江大学医学院附属儿童医院 尚世强 一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能 二、各阶段操作要求 三、PCR污染与对策 四、因操作欠规范导致的问题分析 一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能 规范化设置: 要求参照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002] 10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。 1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记,如加样器或试剂等。 3. 单一方向顺序,从试剂贮存和准备区、 标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简 称扩增区)至产物分析区。 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。 各室功能: (一)试剂贮存和准备区 功能: 贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面,使用可移动紫外灯(254nm波长)照射,一般照射过夜。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 (二)标本制备区 功能: 临床标本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 要正确使用加样器。 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料,必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后,应立即进行cDNA合成。 (三)扩增区 功能: DNA或cDNA扩增。 已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中,第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。 (四)扩增产物分析区 功能: 扩增片段的测定。 膜上微孔板上探针杂交方法、 Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。 本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质,注意实验人员的安全防护。 负压条件。 二、各阶段操作要求 测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。 (一)标本的采集 临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。 EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因肝素是Taq酶的强抑制剂。 玻璃器皿在使用前应高压处理,250°烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。 临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本应尽快(3小时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。 (二)标本的稳定化处理 DNA:不需特殊稳定化处理。 RNA:异硫氰酸胍盐(GITC)可使 DNA酶和RNA酶失活。 (三)标本的运送 可在常温下通过邮寄运送,如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。 未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。 (四)标本的贮存 1. 血清/血浆等— -70℃ 2. 用于DNA
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