糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达及对PG反应性的研究.docVIP

精品论文 参考文献 糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达及对PG反应性的研究 史冬瑶　褚燕　（沈阳市红十字会医院呼吸内科　辽宁沈阳　110013） 【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）4-0054-02 【摘要】目的　观察糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体2（TLR2）的表达水平及其对肽聚糖（PGN）反应性的变化，探讨该变化在糖尿病机体防御病原体感染中的作用。方法　将32只Wistar雄性大鼠用随机数字表法分为正常组（A组），糖尿病组（B组），正常+ PGN组（C组）及糖尿病+ PGN 组（D组）。用免疫细胞化学方法、逆转录一聚合酶链反应(RT PCR)法检测各组大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达的变化。结果　B组及C组大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达与A组相比均明显增高（Plt;0.05）；D组大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达较B组及C组升高更为明显，糖尿病与脂多糖刺激存在交互作用（Plt;0.05）。结论　糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达明显增高，提示糖尿病机体处于促炎症状态,而且我们发现糖尿病与肽聚糖刺激在使TLR2表达增高方面存在交互作用。 【关键词】toll样受体2　糖尿病　肽聚糖 Toll样受体 (Toll2like receptors,TLRs)是近年来新发现的一种同源于果蝇Toll的蛋白分子，TLRs能够对病原体识别、结合、引发一系列信号间的转导,促进各种炎性介质的释放,在早期启动固有免疫应答 对宿主的天然免疫防御具有重要作用[1]。TL R与天然免疫应答关系的研究中,倍受关注的是 TL R2和 TL R4。近期人们对TLRs信号传导途径在糖尿病及其并发症的发生发展中所起的作用日渐重视[2]，但对于糖尿病感染患者TOLL受体的作用我们还知之甚少，此次实验我们研究了肽聚糖刺激下TLR2在正常大鼠及糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞表达，希望能进一步了解糖尿病病人免疫系统功能的变化。 1 材料与方法 1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠32只，SPF级，鼠龄12周，体重（200plusmn;20）克，购于中国医科大学实验动物室,链脲佐菌素:美国sigama公司，PGN( staphylococcus aureus) : Sigma 公司, 谷氨酰胺、小牛血清FCS 、D 2Hanks液、RPM I1640: Hyclone 公司;兔抗鼠TLR2:美国SANTA CRUZ公司。 1.2 方法 1.2.1 将32支雄性Wistar大鼠随机分为4组：正常对照组（A组,n=8），糖尿病组（B组,n=8）, 正常＋PGN组（C组,n=8），糖尿病＋PGN组（D组,n=8）。 糖尿病组一次性腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg体重，对照组注射同等剂量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，72小时后随机血糖ge;16.67mmol/L 为糖尿病模型成功，以后每周复查1 次血糖,连续观察4周[3]。 1.2.2 免疫细胞化学染色：采用免疫细胞化学染色SABC法，染色时兔抗鼠TLR2的浓度为1：200。阳性反应为胞膜和胞浆呈棕黄色着色。各组切片测定阳性细胞单位面积平均光密度值。 1.2.3 TLR2mRNA表达测定:引物委托上海生物工程服务有限公司合成,引物序列如下：上游引物5prime;-CTAAAGTCGATCCGCGACATC-3prime;，下游引物 5prime;-TTCATCAGTGAGAACCGAGC-3prime;，扩增长度为213bp(580ndash;792)，内参照物beta;-actin引物:上游引物ACTGCCGCATGGTG TTCCTG,下游引物AA GCACTTGCGGTGCACGA。将Tripure试剂1mL加入培养皿中，以下步骤按照Tripure 试剂说明要求进行。逆转录—聚合酶链反应( RT—PCR) 严格按照试剂盒说明书进行操作。取各样本RT—PCR 产物10mu;L加样(beta;-actin5mu;L) 和1mu;L上清缓冲液混匀后加于2%琼脂糖凝胶电泳槽齿孔中,50V恒压电泳30min,取胶置凝胶成像系统中拍照,结果扫入电脑备处理。 1.2.4 统计分析：电泳条带比密度值以灰度times;面积/参照物表示,采用SPSS13.0统计软件处理，实验数据用x-plusmn;s表示，各组间指标比较用双因素双水平析因分析，Plt;0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1免疫细胞化学结果 A组大鼠肺泡巨噬细胞可见弱的TLR2表达，以胞浆及胞膜为主呈较淡的棕黄色改变（见图