抗前列腺特异性抗原PSA单克隆抗体的制备、鉴定及其检测试剂盒的初步研制研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 前列腺特异性抗原是前列腺癌最有效的标记物，临床上将血清PSA水平用于颤别 恶性前列腺肿瘤和良胜前列腺增生症。本研究基于血清PSA水平的免疫分析方法，以 前列腺特异性抗原为免疫原，通过杂交瘤技术制备、筛选特异单克隆抗体细胞株，共获 得68株能稳定分泌抗体的细胞株，其中62株细胞分泌的抗体亚类为IgGl类，2株为 IgG2a类，4株为IgG2b类;67株细胞分泌的抗体轻链型为x型，1株为k型。 采用rProteinA一步亲和层析法纯化了20株杂交瘤制备的腹水粗品抗体，纯品抗体 经鉴定后，抗体分子量在 149.39kD-158.02kD，抗体纯度达97%以上，抗体亲和常数为 0.242gg/L-302.0}ig/La2。个纯品抗体与相同摩尔浓度包被的t-PSA,f-PSA,PSA-ACT 反应后证实，PSA-ACT/f-PSA比值在24.9% 103.0%范围内，抗体与PSA的结合位点包 括:(1)同时识别PSA-ACT和f-PSA，即t-PSA的抗体;(2)识别PSA分子与ACT分 子间相邻构象形成的位点。 选择同时识别PSA-ACT和f-PSA的12个纯品抗体进行生物素化标记，并采用 “夹 心”法ELISA分析特异抗体识别前列腺特异性抗原的抗原表位。研究表明，12个抗体 主要识别6个抗原表位，分为6簇:(1)lD4,IE8和6C4抗体;(2)4A11,5H9和16E5 抗体;(3)6H4,9C10和9G12抗体;(4)4E2抗体:(5)8E9抗体;(6)3G6抗体a 经过对识iS,_SA不同抗原表位的抗体筛选和优化，采用 “夹心”酶联免疫吸附检 测法分析了3对抗体建立的检测体系对相同摩尔浓度的t-PSA,PSA-ACT和f-PSA分析 物的反应性，研究结果表明，同一对抗体与t-PSA.PSA-ACT和f-PSA的反应基本一致。 在所建立的检测体系中，以6C4抗体作为捕获抗体、生物素化16E5抗体作为检测 抗体所建立的生物素一亲和素二步反应 “夹心”ELISA法的最低检测限度为0.2}tg/L，批 内检测变异为3.5%，批间变异为5.0%，检测平均回收率为100.2%. 生物素一亲和素二步反应 “夹心”ELISA法分析28份前列腺癌的血清PSA水平为 1.86-92.55阿L，平均为23.14士21.101,i} ;40份BPH血清PSA水平为1.04--18.1Olxg/L, 平均为5.76士4.54gg/L;172份非前列腺疾病和健康男性血清PSA水平为0.14--4.14Pg/L, 平均为 1.1010.81Pg几;30份其他肿瘤的血清PSA水平为0.17-3.52Pg/L，平均为 1.09士。.85gg/L;10份健康女性血清中未测到PSA。经显著性t检验，前列腺癌患者的 血清PSA水平与BPH、非前列腺疾病患者的PSA水平存在显著性差异(t=4.36,P0.01); BPH患者的血清PSA水平与非前列腺疾病患者的PSA水平也存在显著性差异 (r-6.49, P0.01)。 关键词:前列腺特异性抗原;前列腺癌;良性前列腺增生;夹“心”ELISA;表位分析 抗前列腺特异性抗原(PSA)单克隆抗体的制备、鉴定及其检测试剂盒的初步研制 Abstract Prostate-specificantigen(PSA)levelsinserum,whichusedtodiagnosemalignant prostaticcarcinomaandbenignprostatichyperplasiainclinic,isthemosteffectivetumor markerforprostatecarcinoma.Inordertoestablishinununologicalanalyticalmethodsto detectPSA,68hybridomassteadilysecretingMcAbagainsthumanprostate-specificantigen wereobtainedthroughhybridomatechnique,which62/68antibodieswereIgGlsubclasses, 2/68IgG2a,4/68IgG2b,and67/68werexlightchaintype,1/68Xlightchain. The20ascitesantibo