FMD鉴别诊断抗原3ABC的原核表达与纯化及RNAi抑制FMDV复制的初步研讨.pdf

摘要 口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的偶蹄类动物烈性传染病，被国际兽疫局(OfficeInternationaldes Epizooties,0工E)列为A类传染病之首。疫苗接种是防治FMD爆发的主要措施之一， 而要控制FMD流行，首先要将病毒感染动物从疫苗接种群体中区分开来。本文分为两部 分，第一部分为:FMD鉴别诊断抗原3ABC的原核表达与纯化;第二部分为:RNAi抑制 FMDV复制的初步研究。 第一部分在大肠杆菌表达并纯化FMDV非结构蛋白3ABC,旨在为研制FMDV感染和疫 苗接种鉴别诊断试剂盒奠定基础。为构建表达载体，扩增了0型FMDV3ABC片段，插入 到原核表达载体pQE30Xa，利用PCR、双酶切和测序进行鉴定，成功构建了重组载体 pQE3ABC:转化到M15(pREP4)和SG13009(pREP4)宿主菌中表达，表达产物经SDS 分析，大小为40kD左右，经Western-blot检测证明该融合蛋白可以与标准抗0型口蹄 疫抗体发生特异性反应。优化了重组质粒pQE3ABC的表达条件，其结果为:氨节青霉素 和IPTG的适宜浓度分别为100Pg/mL和1mm，在M15(pREP4)和SG13009(pREP4)两个宿 主菌内表达差异不显著。利用镍离子亲和层析柱进行融合蛋白纯化，SDS结果表明 纯化产物较为单一。利用稀释复性法 (超滤)对纯化的融合蛋白进行复性，并利用BCA- 蛋白质定量测定试剂盒测得复性后的融合蛋白浓度为80-100Pg/mL, 本文第二部分为:利用RNAi抑制FMDV在BHK细胞中复制的初步研究，旨在为利用 RNAi防治FMD做一些尝试。FMDV基因组为单股正链RNA，既可作为基因组复制的模板， 又可作为mRNA进行蛋白质翻译，因而很适合于RNAi抗病毒的研究。根据FMDVIRES和 L串联序列两侧的保守区域设计了两个引物，利用RT-PCR和PCR方法扩增出该串联序列， 并进行测序。测序结果表明:工RES非常保守，未出现碱基差异:而L基因则出现了了 个碱基突变。在测序的基础上，选择FMDV的毒力因子L作为靶基因，筛选位于启始密 码子下游第229nt后21nt长的序列为靶位点，在体外利用PCR方法合成了siRNA表达 盒 (SEC)。细胞单层长成50-70%时，用脂质体将纯化的SEC-L229转染到BHK细胞中， 转染4h后用FMDV接种细胞，24h后用间接免疫荧光方法检测口蹄疫病毒在BHK细胞中 的复制情况.研究结果表明:SEC-L229以序列特异性方式极大地抑制了口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制 (80%)，并降低了BHK细胞的死t率。25ng和50ngSEC-L229处理 组间对病毒复制的抑制作用差异 (剂量依赖性)不显著。本研究初步表明，利用PCR方 法合成SEC快速、经济，SEC可特异性地抑制BHK细胞中FMDV的复制，RNAi技术可能 为防治口蹄疫提供一个新的途径。 关键词:FMDV，鉴别诊断抗原3ABC，原核表达，RNAi，抑制，病毒复制 Abstract Foot-and-mouthdisease(FMD)causedbyfoot-and-diseasevirus(FMDV)isahighly contagiousdiseaseamongclovenhoofedanimalsandwaslistedfirstamongtype-Ainfectious diseasebyOfficeInternationaldesEpizooties(OIE).Vaccinationisamainmeasureto preventandcureFMDinmostcountrieswherethisdiseaseexists,butinordertocontrol FMD,thefistthingtodoisdifferentiatingvirusinfectedandcarrieranimalsrfomvaccinated population.Thepaperisdividedintotwoparts,andthefirstpartisabouttheprokaryotic expressionofdiagnosticantigen3ABCofFMDanditspurification;thesecondparti