动物遗传育种学实验指导 - 西南大学荣昌校区动物科学系.docVIP

动物遗传育种学实验指导 向钊 王维林 王玲 周沛 周萍 西南大学荣昌校区 二OO八年二月 目录 实验一 小鼠骨髓细胞染色体标本制作 2 实验二 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 5 实验三 染色体显带技术 9 实验四 染色体组型分析 15 实验五 植物多倍体诱发 20 实验六 果蝇的单因子杂交实验 22 实验七 人群单基因遗传基因频率分析 27 实验八 群体蛋白多态聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测 33 实验九 动物血液DNA提取 39 实验十 RAPD——动物DNA多态检测 42 实验十一 遗传力计算 44 实验十二 遗传相关计算 47 实习十三 体尺测量与外貌鉴定 49 实习十四 生长发育的计算与生长曲线的绘制 52 实习十五 体重估测与体尺指数的计算 56 实习十六 家畜的摄影 59 实习十七 系谱的编制 63 实习十八 系谱审查后裔测验 69 实习十九 个体育种值的估计 73 实习二十 选种指数的制订与计算机应用 76 实习二十一 近交系数与亲缘系数的计算 85 实习二十二 群体有效含量的计算 88 附录一 器皿清洗与灭菌消毒 91 附录二 培养液和常用试剂的配制 94  实验一 小鼠骨髓细胞染色体标本制作 一、目的和要求 通过这一实验，要求学生了解哺乳动物染色体标本的制作方法，并对动物染色体进行观察。 二、实验原理 由于中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 三、材料、试剂与仪器设备 材料：小白鼠。 设备：注射器、5#针头、10ml刻度离心管、1ml吸管、试管架、载玻片、天平，离心机，显微镜、解剖器具。 药品（配方见附录）： 秋水仙素（100μg/ml）； 姬姆萨染液； 固定液； 低渗液； 生理盐水； 2％的柠檬酸钠溶液； 0.075mol/L　kcl。 四、实验步骤 总体步骤：秋水仙素处理——取骨髓——低渗处理——固定——离心——再固定——再离心——滴片——染色——镜检——封片。 1、注射秋水仙素 取65-90日龄健康小鼠，实验前3-4h左右，腹腔注射秋水仙素（100μg/ml） 0.3-0.4 ml。 注射部位很重要，对于一般啮齿类注射部位为左或右下腹。将针头2/3刺入腹腔后，要轻轻上挑，再行注射。注意一定要注射到腹腔内。秋水仙素的主要作用是：抑制细胞分裂。 2、取骨髓： 断颈处死动物，迅速取出后肢长骨，清除股骨上的残余肌肉，并用2％的柠檬酸钠溶液冲洗干净，剪掉股骨两端关节膨大的关节头，暴露骨髓腔，用注射器连接５号针头吸取适量2％的柠檬酸钠溶液对准截断的长骨髓腔，轻推注射器，冲洗髓腔中的骨髓细胞至平皿内，连续冲洗数次，直至髓腔干净为止，小心地用滴管将骨髓细胞悬液移至10ml刻度离心管中。 3、低渗处理 将离心管放在离心机上，1000r/min速度离心10min，弃去清液，加上低渗液7-8ml低渗液（0.075mol/L　kcl），处理25分钟。 4、固定 低渗后以1000r/min速度离心10min。弃去上清液，加入7ml固定液（甲醇：冰HAC＝3:1）,用滴管轻轻打散细胞团块，继续固定30min，再以1000r/min速度离心10min，弃去上清液，加入3-5ml固定液第二次固定30分钟，1000r/min速度离心10min，弃去上清液，加入甲醇：冰HAC＝1：1固定液固定20分钟。然后1000r/min速度离心5-10min，除去上清液，留0.1-0.2ml细胞团和上清液，再加入少许新鲜1：1固定液（约5倍体积），摇匀成细胞悬液。 5、滴片 在制作标本片前1-2小时,区洁净的载玻片保存于0-4度的冰水中. 制作标本片时将沉淀物吹打均匀后，吸于滴管内，滴在冰冷洁净载玻片，每片2～3滴，酒精灯上烘烤一下，放在片盘上，空气干燥法制片，干燥后，加注标签. 6．染色和观察 将标本片反扣在染色缸上,将1:10的Giemsa染液染色缓缓加入染色缸标本片下,不能形成气泡。扣染30分钟后，自来水冲洗。待制片干燥后置显微镜下观察。 在显微镜下观察小白鼠染色体的形态、数目及结构特征。在正常的2n情况下，雄性小白鼠有3个最短的染色体（19号染色体一对和y染色体），雌性有2个最短的染色体（19号染色体一对）。 五、作业 选择染色体清晰，分散度好的细胞显微摄影，待做核型分析。绘出所观察到的有丝分裂图像。 实验二 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 一、目的与要求 1、初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法。 2、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法 二、实验原理