绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达精选.pdf

云南农业大学学报　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１２，２７（６）：８２０－８２５ ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｎａｕｅｄｕｃｎ ＩＳＳＮ１００４－３９０Ｘ；ＣＯＤＥＮＹＮＤＸＡＸ Ｅｍａｉｌ：ｘｂ＠ｙｎａｕｅｄｕｃｎ ＤＯＩ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１００４－３９０Ｘ（ｎ）２０１２０６００９ 绿色荧光蛋白基因原核表达质粒ｐＥＴ３２ａＡｃＧＦＰ１ 的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 １，２＃ １＃ １ ３ ４ 霍海龙 ，赵　跃 ，王　锐 ，侯慧芳 ，李卫真 ， ５ １ ４ ４ 张永云 ，刘丽仙 ，王　配 ，霍金龙 （１．云南农业职业技术学院畜牧兽医系，云南 昆明６５００３１；２．云南大学 生命科学学院，云南 昆明６５００９１； ３．忻州市农业机械管理局 山西忻州０３４０００；４．云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明６５０２０１； ５．云南农业大学 农科专业基础实验教学示范中心，云南 昆明６５０２０１） 摘要：为了构建绿色荧光蛋白ＡｃＧＦＰ１基因的原核表达载体ｐＥＴ３２ａＡｃＧＦＰ１，并诱导使其在大肠杆菌中高效表 达，本研究以ｐＩＲＥＳＡｃＧＦＰ１质粒为模板，采用ＰＣＲ技术特异性扩增绿色荧光蛋白ＡｃＧＦＰ１基因，通过酶切和 连接使其与原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）构成重组子，经ＰＣＲ、酶切和测序鉴定后，重组质粒转化大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３），用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）诱导表达绿色荧光蛋白，经 １５％ ＳＤＳＰＡＧＥ鉴 定，结果显示：重组质粒ｐＥＴ３２ａＡｃＧＦＰ１中的ＡｃＧＦＰ１序列与Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的ｐＩＲＥＳＡｃＧＦＰ１质粒的ＡｃＧＦＰ１ 序列完全一致，表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因ＡｃＧＦＰ１的原核表达质粒。此外，ｐＥＴ３２ａ ＡｃＧＦＰ１转化Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３），经不同浓度的ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳＰＡＧＥ检测均获得高效表达，为今后构建ｐＥＴ３２ａ （＋）ＴＡＴＡｃＧＦＰ１融合表达载体以及深入研究ＴＡＴ的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白；基因克隆；报告基因；原核表达 中图分类号：Ｑ７８２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４－３９０Ｘ（２０１２）０６－０８２０－０６ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｌａｓｍｉｄｐＥＴ３２ａ ＡｃＧＦＰ１ｏｆＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＴｈｅｉｒＨｉｇｈ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ １，２ １ １ ３ ４ ＨＵＯＨａｉｌｏｎｇ ，ＺＨＡＯＹｕｅ，ＷＡＮＧＲｕｉ，ＨｏｕＨｕｉｆａｎｇ，ＬＩＷｅｉｚｈｅｎ， ５ １ ４ ４ ＺＨＡＮＧＹｏｎｇｙｕｎ，ＬＩＵＬｉｘｉａｎ，ＷＡＮＧＰｅｉ，ＨＵＯＪｉｎｌｏｎｇ （１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ，ＹｕｎｎａｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌａｎｄＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００３１， Ｃｈｉｎａ；２．ＦａｃｕｌｔｙｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＹｕｎｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００９１，Ｃｈｉｎａ； ３．ＢｕｒｅａｕｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＭａｃｈｉｎｅｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＸｉｎｚｈｏｕＣｉｔｙ，Ｘｉｎｚｈｏｕ０３４０００