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材料 植物材料: 甘薯潮薯1号:购于四川省农科院，自然栽培，取其各组织材料。 甘薯潮薯1号、绵粉1号、徐薯18用于测定不同品种甘薯光合作用与生产力的关系。 动物材料 新西兰大白兔购自四川大学华西啮齿动物实验中心，适应性饲养1周后进行免疫反应。 常规的分子生物学技术 ( RNA提取、反转录、PCR、酶切……) 大肠杆菌表达及产物纯化 多克隆抗体制备及效价检测 Western blot及RT-PCR检测 结 果 IBrcaI基因全长及ORF序列的克隆与分析 IBrcaI基因的表达与纯化 多克隆抗体的制备和效价检测 甘薯IBrcaI基因表达产物的western 检测 甘薯IBrcaI基因表达的组织与时间特异性分析 不同甘薯品种光合作用与生产力的关系分析 不同品种甘薯干率 潮薯1号: 19% 徐薯18: 26% 绵粉1号: 29% 讨 论 1 甘薯IBRcaI基因cDNA的原核表达 改变诱导时的温度和时间，表达产物总是以包涵体的形式存在。 可能是因为在大肠杆菌表达系统中缺少该基因翻译后修饰所需的某些酶类。 2 Western检测 在甘薯叶片中含有2种Rubisco活化酶 由于mRNA经过不同的剪接？ 由2种不同的基因编码而形成的？ 2种不同大小的蛋白有何作用？ 3 IBRcaI的差异表达分析 IBRcaI基因的表达除了受到光调节之外还可能受到其它因素的影响 可能是导致甘薯在正午的时候出现的“光合午休”的现象的原因之一 4 不同品种甘薯光合与生产力关系的分析 在甘薯的生长前期，光合作用生成的物质积累主要体现在薯块的膨大与茎叶的成长 生长后期，光合作用生成的物质则主要起到了干物质积累的作用 致谢 * 四川大学硕士学位论文答辩 答 辩 人: 许 可 专 业: 生物化学与分子生物学业 方 向: 基因的分子生物学 指导教师: 张义正 教授 甘薯（Ipomoea batatas (L). Lam）Rubisco 活化酶基因的克隆和表达 研究背景 研究意义 研究内容 技术路线 材料和方法 结果 讨论 致谢 研 究 背 景 甘薯具有广泛的种植面积 甘薯含丰富的淀粉，能够用于工业乙醇的生产 生产条件限制使利用甘薯生产工业乙醇成本较高 提高光合效率以提高甘薯产量 Rubisco 活化酶是植物光合作用的关键酶 Rubisco活化酶作用机制 研 究 意 义 在甘薯中Rubisco 活化酶末被克隆 在甘薯中Rubisco 活化酶组成情况不明确 在甘薯中Rubisco 活化酶表达情况不清楚 对Rubsico 活化酶进行深入的分了生物学研究为以后利用分了生物学进行改造奠定了基础 研 究 内 容 甘薯Rubisco活化酶基因克隆、表达及纯化 多克隆抗体制备及效价检测 Western检测Rubsico 活化酶在甘薯中的组成情况 甘薯Rubsico 活化酶基因表达的组织和时间特异性 分析 不同品种甘薯光合作用与生产力的关系分析 技 术 路 线 正常生长甘薯植株 采集叶片 提取总RNA 提取Rubisco活化酶 RT-PCR分析 利用RACE技术克隆基因全长 克隆基因ORF 构建原核表达载体 表达、纯化 制备多克隆抗体 抗体检测 Western 检测 选择甘薯品种 小区试验种植 利用便携式光合仪测定净光合速率 测定各品种生物产量 进行比较 根据报道的物种的保守序列克隆IBrcaI片段 材 料 和 方 法 5’-GGAATTCAGTGAGGCCTCGTGCTTAGC-3’ 含EcoRI位点 IBrca-E2 扩增IBrca编码序列 5’-CATGCCATGGCTACCTCCAGTGTCC-3’ 含NcoI位点 IBrca-E1 5-TCCATAAGAGGGCATAACTAGTG-3 IBtub-2 Tublin扩增 5-CAACTACCAGCCACCAACTGT-3 IBtub-1 5- AATTTGTTTCATCCAAATTTTATTTG-3 IBrcaI-R ORF扩增 5-TCAACTTTGAATTGAACTTCAGCA-3 IBrcaI-L 5-TTTCCTTGACCTTTGCCTCCCCAGA-3 IBrcaI-5 5-TGGGTTTTACATTGCCCCTGCCTTC-3 IBrcaI-3: 5-GTGGCGTTCACCATCTGGTTG-3 IBrca-2 5-ATCCATGGCTGCCTCCGTCTC-3 IBrca-1 5-ACGGAGGGNGGGGNGGGGGG-3 IBAP 5-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 UPM2 5-CTAATACG