第7章 原核细胞基因工程.ppt

寡聚型异源蛋白的表达 以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白高效表达 在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以 稳定表达小分子短肽 在一定程度上改善表达量 目的产物回收困难 短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。 串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶 降解的能力大幅度提高 寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后 的短肽分子容易出现序列不均一性 寡聚型异源蛋白的表达 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 P SD gene gene gene gene T1 T2 H2N COOH Met Met Met Met mRNA CNBr 基本战略： 寡聚型异源蛋白的表达 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 构建举例： P SD T1 T2 EcoRI BamHI AATTCAGATCT GTCTAGA G CCTAG EcoRI Bgl II BamHI EcoRI BamHI Bgl II GATCT A G CCTAG EcoRI BamHI Bgl II EcoRI BamHI Bgl II EcoRI + BamHI Bgl II + BamHI BamHI 整合型异源蛋白的表达 以整合形式表达目的蛋白的优缺点 目的基因表达稳定 整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大 多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续 目的基因表达率低 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达 元件而加以补偿 培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目 的的基因工程案例特别有意义 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类： 转位因子依赖型 同源序列依赖型 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如： 转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族 噬菌体 G片段（G-Fragment） 原核细菌 插入顺序（IS） 真核细菌 转座子（Tn、Ty） 高等植物 可移动因子（Ac、Ds） 高等动物 跳跃基因（mobil gene） 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构 IS（1 kb） Ty（5 kb） Tn（2 - 20 kb） ACCATGGTT TTGGTACCA 抗药性基因 转位酶基因 识别位点 阻遏基因 IR IR IR IR IS IS 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：整合形式 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。 同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点 同源序列依赖型的体内重组：基本形式 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源整合 ori 目的基因 同源区域 标记基因 整合位点 染色体DNA 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源交换 ori 目的基因 同源区域 标记基因 交换区域 染色体DNA ori + 第三节 基因工程菌的大规模培养 基因工程菌（简称工程菌）的大规模培养主要采用和借鉴微生物工程发酵的方法，通过工程菌的大规模发酵培养，实现外源基因表达产物的工业化生产。 基因工程菌的大规模培养过程 通过摇瓶操作研究基因工程菌生长的基础条件，如温度、pH值、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响等，并为大规模培养提供高纯度菌种。 通过培养罐操作确定规模化培养的参数和控制方案以及顺序，完成代谢产物分离。 菌种 一级种子摇瓶扩大培养 二级种子罐培养 原料 发酵培养基配制 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基因工程菌的发酵生产流程 一、基因工程菌发酵的特点 发酵产物生成的代谢途径不同 基因工程菌存在遗传不稳定性 基因工程菌发酵的其他特点（生产规模较小，设备自动化程度要求高，产品附加值高，生产利润大，防扩散等） 二、基因工程菌的深层培养方式 深层培养：指与表面培养相对应，使用固体或液体培养基在固定的容器内通入无菌空气进行培养