第三章 基因克隆载体1.ppt

丝状噬菌体，内有一环状单链DNA分子（“+”链DNA） 大小：6.4kb 结构：10个区　 基因间隔区507bp （intergenic region ，IG区） 含复制起始位点及可插入外源DNA的位点 三、M13噬菌体克隆载体 （一）M13 DNA 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 三、M13噬菌体克隆载体 （一）单链DNA噬菌体的特征 (1) +DNA（ssDNA）. (2) 复制型是双链DNA为中间媒介。 M13噬菌体感染雄性大肠杆菌后，M13的“+”DNA进入细胞，以此为模板复制“-”DNA,,由此产生的DNA为双链DNA（RF-DNA）。 RF-DNA一般按照环状双链DNA进行复制，同时按照“+”DNA转译出一些包装蛋白。当RF-DNA达到一定数量时，“+”DNA被阻遏蛋白结合，阻断“-”DNA复制合成。 结果细胞只能以“-”DNA为模板合成新链“+”DNA，而新链“+”DNA被积累在细胞内的壳蛋白包装成噬菌体，不断被挤出宿主细胞。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 （一）单链DNA噬菌体的特征 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 （一）单链DNA噬菌体的特征 （二）M13的生活周期 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 三、M13噬菌体克隆载体 +DNA转录mRNA 翻译形成噬菌体蛋白， -DNA合成+DNA。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 策略： 在RF-DNA的IG区插入选择标记基因，并组装合适MCS。 1.克隆区域的选定 （2）酶切位点 （1）基因间隔区（intergenic region ，IG区） 该区域只有一个BsuI酶切位点 ，其余9个在其他部位。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 （三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 三、M13噬菌体克隆载体 含复制起始位点及可插入外源DNA的位点（不影响M13噬菌体活性）。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 （三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 三、M13噬菌体克隆载体 2.加入酶切位点 （1）在IG区加入酶切位点 在IG区内插入大肠杆菌的LacZ序列（a-肽序列）。 利用a-肽序列的三个单一酶切位点（Bgl II 、Ava II和Pvu I） 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 （三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 三、M13噬菌体克隆载体 研究E.coliDNA复制时，采用3H标记的T ，经放射自显影和电子显微镜拍照，展示了“θ”形结构而得名。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 这种复制方式在下列生物DNA中有： （1）噬菌体：M13、φ?174、G4、λDNA基因复制。 （2）细菌：E.coli DNA、细菌致育因子F。 （3）真核生物：非洲爪蟾卵母细胞rDNA的复制。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 滚环复制过程 （1）双链环状DNA的（+）链从“ori”处切刻开。5’-端离开环。 (-) 5’ ori （+） 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 DNA聚合酶以（-）链环为模板，从（+）链的3’-OH端共价延伸，合成子代（+）链DNA。 (-) 5’ 3’ (2) SSB覆盖在（+）链的5’-端单链上， （+） 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 (4)DNA聚合酶以延伸的单链DNA为模板，合成子代双链DNA。 (-) 5’ 3’ 3’ 5’ (3)象拉卷尺一样，（+）链越拉越长。 * （+） 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 (5) 连接各岗崎片段，子代DNA形成线状或环状。 (-) 5’ 3’ 3’ 5’ * （+） 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 对大肠杆菌有很高的感染性，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞里，容易保存。在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量繁殖。 2、能承载较大的外源DNA片段 λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点 （二）构建依据 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 策略: 切去部分非必需区; 删掉多余的限制性内切酶位点; 插入选择性标记基因; 建立体外包装系统。 3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ噬菌体克隆载体 （三）构建的基本策略与技术路线 技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES–λβ为例，EcoRI（如图）。 （48.5kb） λDNA E co R I 6个