2017-2018学年高中生物 专题5 DNA和蛋白质技术 5.3 血红蛋白的提取和分离课件 新人教版选修.pptVIP

合作探究 自主预习 合作探究 自主预习 自主预习 合作探究 自主预习 合作探究 自主预习 目标导航 预习导引 1.会提取和分离血液中的血红蛋白。 2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 3.能说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。 目标导航 预习导引 一 二 三 一、基础知识 蛋白质的各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等,可以用来分离不同种类的蛋白质。 1.凝胶色谱法 (1)概念:凝胶色谱法也称做分配色谱法,是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 (2)原理:大多数凝胶是由多糖类化合物构成的小球体,小球体内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 目标导航 预习导引 一 二 三 (3)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖或琼脂糖。 (4)具体过程 ①蛋白质混合物上柱;②洗脱开始,相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内;相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外;③相对分子质量较小的蛋白质被滞留;相对分子质量较大的蛋白质向下移动;④相对分子质量不同的分子完全分开;⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短,已从层析柱中洗脱出来,相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 目标导航 预习导引 一 二 三 2.缓冲溶液 (1)作用:在一定范围内,能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。 (2)配制:通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 3.电泳 (1)概念:带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 (2)原理:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定pH下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。 目标导航 预习导引 一 二 三 (3)分类:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中,SDS能使蛋白质发生完全变性,由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 目标导航 预习导引 一 二 三 二、蛋白质的提取和分离 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 1.样品处理及粗分离 血液由血浆和各种血细胞组成,其中红细胞最多。在红细胞的组成中,除水分以外,约90%是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成,包括两条α-肽链和两条β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。 目标导航 预习导引 一 二 三 (1)红细胞的洗涤 ①目的:去除杂蛋白。 ②方法:采用低速短时间离心,如500 r/min离心 2 min。 (2)血红蛋白的释放 目标导航 预习导引 一 二 三 (3)分离血红蛋白溶液:将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层(从上往下)。 第1层:无色透明的甲苯层。 第2层:脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。 第3层:血红蛋白的水溶液——红色透明液体。 第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。 将液体用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。 (4)透析:取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12 h。 透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃纸)制成的,能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。 目标导航 预习导引 一 二 三 2.纯化——凝胶色谱操作 处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等),因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。 第一步要制作凝胶色谱柱。第二步要装填凝胶色谱柱,因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时,不能有气泡