厚朴组织培养与高产细胞系建立技术研讨.pdf

中国首届农业生物技术发展论坛文集 ChIna F盯吼AgriculturalBio-technologyDevelo仁meritSymposium 厚朴组织培养与高产细胞系建立技术研究 童再康1 朱玉球1 王章荣2 (1浙江林学院，临安311300； 2南京林业大学林木遗传与基因工程重点实验，南京210037) 摘要本文对来自厚朴种源试验林的10个不同基因型材料开展组织培养和高产细胞系 建立研究，结果表明：基本培养基、激素种类与配比、外植体的取材部位等因素对厚朴愈伤 最高，褐化率最低；140、54二个基因型的细胞增殖最快，是其他基因型细胞均值的2．12 倍；不同的基因型、培养基、培养时间所产生愈伤组织细胞的厚朴酚类含量不同，以140基 因型的细胞系在B+BA2．0rag／L+NAAl．0mg／L的培养基上培养60d为最优。 关键词厚朴；组织培养；愈伤组织；细胞培养；厚朴酚；和厚朴酚 Rehet 厚朴(MagnoliaofficinalisWls)是我国特有的、常用的珍贵中药材厚朴皮、花的原植 物，分布于亚热带地区n’23。因其特殊的分类地位和资源的日益枯竭而被列为国家珍稀濒危植物‰引。 厚朴药材的有效成分主要是酚类物质和生物碱，其中，厚朴酚(Magnol01)及其异构体和厚朴酚 来，厚朴人工栽培得到普遍重视，相继在湖北、江西、浙江、湖南、四川、河南等省建立了较大面积 的人工林。但随着厚朴药材利用途径的不断开发，不仅野生资源日益减少，人工林资源也远远不能满 足需求。因此，探讨利用现代生物技术，通过细胞培养生产厚朴酚类物质具有十分重要的意义。 利用现代生物技术，试图通过组织培养、细胞培养探讨生产药物有效成分的设想已在红豆杉、 人参等多种植物上作了研究，取得了一些有益的进展口J】。刘贤旺等(1997，1996)研究了凹叶厚 朴[^么officinalis 诱导芽形成愈伤组织的基本培养基∞棚。本文利用厚朴种源试验林中厚朴酚类物质含量高的单株材 料诱导愈伤组织，探讨通过细胞培养，筛选细胞增值快、厚朴酚类含量高的细胞系等技术，为进一 步开展厚朴生物工程技术研究和了解厚朴酚类物质合成途径提供基础。 一、材料与方法 【一)材料 采自厚朴7年生种源林不同厚朴酚、和厚朴酚含量的10个单株，每株8-10个一级侧枝的顶 芽用作组织培养外植体。 (二)方法 1．外植体消毒、接种与培养先用洗涤剂清洗、漂净外植体，在无菌条件下用70％乙醇消毒 ·82· 学术论文 ChinaF们at D副刊晖lmentSympos椭 A口ric蛐ucalBio-伯甘n)bgy 500--一2000 25±2℃，每日光照12h，光照强度为1 lx。 2．培养基、激素种类和浓度配比的设计选择DCR、135、White3种基本培养基，附加2，4一 选3种浓度，采用正交设计法进行基本培养基、激素种类和配比对愈伤组织的诱导和褐化筛选(设 计见表1)。 以B5为基本培养基，设计NAA6种浓度(o、0．1、0．5、1．0、2．0、4．0mg／L)、BA4种浓 度(o．1、0．5、1．0、2．0mg／L)构成24个组合的培养基，筛选高产细胞系最佳培养基。 3．愈伤组织细胞厚朴酚含量测定按中国药典(2000)规定的方法口1，称取509愈伤组织利用 HPLC法测定厚朴酚、和厚朴酚含量，以于物质计算酚含量百分率。 4．数据处理与统计分析实验测定的数据按设计要求进行正交设计方差分析、随机区组方差 分析和邓肯氏多重比较。计算均在DPS(DataProcessingSystem)统计平台上运算口叩。 二、结果和分析 一、二口木1、J川’17I (一)基本培养基和激素对愈伤组织的诱导与褐化的影响 在植物组织培养过程中，基本培养基为离体条件下植物组织生长提供营养来源。而要诱导外