梨S基因PCR扩增体系的优化研究.pdf

梨S基因PCR扩增体系的优化 齐国辉徐继忠 张玉星王国英 (河北农业大学，保定071000) 摘要：通过对梨S基因PCR扩增反应程序中的重要参数进行梯度试验，建立了梨S基因 PCR PCR扩增最佳反应体系：即在20／zl反应体系中，10XBuffer2．0／A，25mMMgCl22．0／A (2．5raM)，2．5mM DNA Taq 聚合酶0．2止(1U)，模版DNA30ng，补灭菌重蒸水至20／A。 关键词：梨；S基因，PCR扩增，反应体系 在配子体自交不亲和系统中，不亲和性主要是由单个基因座上的S复等位基因控制 的[1I，确定植物自交不亲和基因型是当前自交不亲和研究的重点。确定果树S基因型传统的 Komori等rz]用杂交的 方法是通过杂交后坐果率的调查或观察花粉管的生长来进行。Sadao 方法确定了9个苹果品种的S基因型；寺兄魔雄等[3]用这种方法鉴定了一些梨品种的S基因 型，但这种方法耗物费时，使得果树品种S基因型的鉴定工作进展缓慢。近年来，随着分子 生物学研究的不断深入，一些先进手段不断用于果树品种S基因型的鉴定，如应用花柱可溶 性蛋白的等电聚焦电泳及分子标记技术等，鉴定出一些梨品种的S基因型[4~5]。最近又发现 的系统，即用具有单一识别位点的限制性核酸内切酶消化PCR扩增片段，然后根据核酸内 鉴定出S基因型的梨品种中，以日本梨居多，中国梨品种的§基因型鉴定则刚刚起步口0I， 因此急需加大力度进行研究。 本文摸索了梨S基因PCR扩增体系的优化条件，．以便为高效扩增S基因奠定基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1植物材料 (S5S6)、长寿(S1S5)[1 210梨科研与生产进展(三) 嫩叶，用冰盒带回实验室，--40℃冰柜中保存。 1．1．2酶、试剂 Taq Rnase Marker为MSM34(100bp+1．5kb)DNALadder，系上海生工公司产品；其他试剂均为超 纯或分析纯。 ’。 1．1．3PCR引物 WPNV”分别设计正向引物P1 根据s1一，RNase基因保守序列“FTQQYQ”和“anti-1I 和反向引物P2[sI，引物由上海生工生物工程有限公司合成。 引物序列分别为： P1：5’一TTTACGCAGCAATATCAG一3’ P2：5’一AC(A／G)TTCGGCCAAATAATT一3’ 1．2试验方法 1．2．1基因组DNA的提取和纯化 采用改良的CTAB法[13|，纯化后的DNA用适量TE溶解，--20℃保存。 1．2．2DNA浓度和纯度检测 Uv_VIS 8500分光 将提取的DNA用0．8％的琼脂糖凝胶进行检测，然后用Techcomp 合要求。DNA浓度(pg／p1)一OD260×50×稀释倍数／1000。 1．2．3梨争基因PCR反应体系的建立 、 梨孓基因PCR反应体系的建立中主要进行以下试验： Buffer MgCl2 一基本反应体系为(20／卫1)：10×PCR2．o弘1，20mM 1．6p1，2．5mM Taq dNTPl．6弘l，5pM引物各3．0pl，5U／pl