流行性乙型脑炎病毒SA14142株E蛋白在原核细胞中的高效表达以及ELISA诊断试剂盒的初步研讨.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典疑第十次学术研讨会论文集 及ELISA诊断试剂盒的初步研究+ 杨耀武“2齐香荣1陈德胜1何孔旺3陈溥言1沈国顺2 0095 (1．南京农业大学动物医学院传染病组农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室，江苏南京21 2．沈阳农业大学畜牧兽医学院动物医学系，辽宁沈阳110161； 0014) 3．江苏省农业科学院畜牧兽医研究所，江苏南京21 Encephalitis BVirus) 流行性乙型脑炎(Epidemic 又称日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitis 要分布在东南亚及太平洋西部地区，估计每年有数万人发病，病死人数超过l万人，病死率在25％左右， 致残人数约1．5万，留有不同程度的神经、精神后遗症，占存活者的50％。我国是乙脑发病人数最多的 国家，占世界总发病数的80％以上，病死率10％以上，幸存者中约有15．3％留有不同程度的后遗症。 在动物中，猪对JEV的感染最普遍，它与蚊形成了“蚊与猪”循环传播模式，血清学检测猪抗体阳 性率达90％以上。此病可引起妊娠母猪流产、死胎；公猪发生睾丸炎；仔猪因脑炎死亡。给养猪业发展 带来巨大的经济损失。特别近年来随着全球气候的变暖，乙脑病例呈上升趋势。我国西藏也开始有血清学 阳性猪群出现。但常用的补体结合试验、血凝抑制试验、中和试验等血清学诊断方法只能在恢复期血清抗 体升高时作回顾诊断，不能达到早期诊断的目的。因此迫切需要一种简便、迅速，便于推广使用的早期诊 断试剂盒，以尽快淘汰阳性猪，保证养猪业的持续、高产发展。 因组只有一个读码框架，编码一个全长3432个氨基酸的多蛋白前体。该多蛋白前体经蛋白酶切割加工， 由共编码的E蛋白是病毒粒子表面最重要的结构蛋白，其表面的抗原决定簇，具有血凝括性和中和活性。 E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。本研究 利用RT—PCR技术扩增了JEVE蛋白基因主要片段，将之克隆入大肠杆菌中进行高效表达，并利用间接 ELISA对表达产物的抗原性进行检测。为进一步利用原核表达产物研制诊断试剂盒奠定基础。 1材料与方法 1．1材料 1．I．1毒株：JEV减毒株SAl4—14—2，由江苏省农业科学院畜牧兽医研究所提供。 保存；测序克隆载体pGEM—Teasy为Promega公司产品。 1．1．3主要试剂：Tripure 反转录酶为Promega公司产品；限制性内切酶EcoRI、HindIll，T4DNA连接酶，rTaqDNA聚合酶 Bind 为大连宝生物工程有限公司产品；DNA凝胶回收试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品；His Purification 医药集团上海化学试剂。 1 2方法 +书金项日：围家商技术研究发腱(863)计划(2001AA249012) 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 (P。)处和第2040～2067bp(P2)处设计一对引物： GcGAATTCATccTccTGcTGTTGGTc3’ P1(5’)：5’ GcG从GcTTGGAAGGGGTTcAcTGTcAc3’ P2(3’)：5’ 1．2．2病毒基因组RNA的提取利用Vero传代细胞增殖病毒，收毒后，参照TripureRNA提取试剂盒 说明进行细胞毒总RNA的提取，然后室温自然干燥，溶于10¨1DEPC处理水中备用。 I．2．3 个循环，72℃延伸10min，冷却至4℃，结束反应。行0．8％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。 1．2．4克隆与鉴定将RT—PCR产物与克隆载体pUCl9分别经EcoR 凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DHSa感受态，涂布于含 Amp+(5q