【医学超级全核医学】第六章 PPT.ppt

第六章 体外分析;定义;放射分析方法或其派生的相关技术 在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。 测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、其它生物活性物质和药物浓度等。;体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线不引入人体内、应用面广、方法简便等优点。是对多种疾病诊治和研究的重要方法之一。 1959年由美国 Berson Yalow建立了本方法， Yalow为此在1977年获得诺贝尔医学与生理学奖 ;体外分析技术建立的基础:;定量手段 (标记配体作为示踪剂);体外分析技术;放射免疫分析radioimmunoassay, RIA;放射免疫分析法是Yalow和Berson于1959年在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。 结合了放射性核素的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。;一、RIA的基本原理;基本原理;Ag;（二）剂量反应曲线：标准曲线;标准曲线的绘制方法;;B%;未知样品的测量;Ag;B%;在实际的操作中，一般要设立： 最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。 非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。;总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。 标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。 样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。;选用不同的反应变量作纵坐标，标准曲线的形状也不同。 常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等。;标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度 ;（一）标准抗原;标准抗原的要求：;2、定量要准确： 整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。 只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析系统的准确度和精确度。;3、必须高纯度： 标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。 4、稳定性要好： 要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该不发生降解，分离、破坏等。;1）比活度和放化纯度足够高;标记抗原的要求;3、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。 放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免疫反应和动力学参数产生影响。 由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。;4、标记抗原的稳定性要好： 和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。 在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。;（三）特异性抗体;抗体的要求（三高）;抗体的检测指标;2、交叉反应率： 指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。 在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。 ;常用50%置换法来测定交叉反应的百分率。 即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管（B/B0）的50%时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活力。 ;3、滴度： 又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。 指在没有标准抗原存在的时候，结合50%的标记抗原时抗血清的稀释度。 其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡后分离B和F，测出B的放射性，算出B%，以B%为纵坐标以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，B%为50% 所对应的抗血清滴度为工作滴度。 ;三、RIA的分离方法;（一）分离方法的要求;（二）非特异性分离方法;2、过滤法： 用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而留在滤膜上，达到分离的目的。 常用0.22μm的醋酸纤维薄膜。;3、沉淀法： 在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一