临床pcr检验标本的采集、处理、保存及核酸.pptxVIP

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法;检验误差的发生率;正确采集、运送、保存临床标本的重要性;核酸提取的重要性;标本采集;标本运送 ;临床标本的处理和保存;血清（浆）;全血;外周血单个核细胞 ;痰;痰标本处理的基本模式;痰标本处理通用模式;一定体积的痰;痰标本处理简单模式 ;痰标本处理中要注意的问题;棉拭子;脓液;体液;乳汁;乳汁中分枝杆菌DNA的提取;乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清;组织 ;临床标本的滤纸上保存;临床标本中PCR反应抑制物;肝素的作用机理 ;肝素的作用机理;血红蛋白、乳铁蛋白;IgG ;去除或减轻抑制的一些方法;去除或减轻抑制的一些方法;核酸纯化;一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理;核酸的分离纯化 ;DNA提取的经典方法;RNA提取的独特性; RNA提取所用器皿的处理;RNA提取所用溶液的准备 ;RNA提取中RNase 污染的控制;RNA提取的常用方法 ;异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法 ;核酸提取的改良方法 ;旋转离心柱（SPIN COLUMN）;玻璃粉吸附法 ;二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 ;使用NaI的微量全血核酸提取法 ;全自动核酸纯化仪;全自动核酸纯化仪;全自动核酸纯化仪;全自动核酸纯化仪;靶核酸提取的质量 ;谢谢！;;一、标本收集、运送、保存1、标本收集 临床基因扩增检测实验室对各种临床标本的收集应按检测要求建立标准操作程序，并对临床标本采集人员培训。标本采集的时间，应在患者疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。 ;（1）标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物，但应适度，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。 （2）标本的类型和采集量 标本的类型 和采集量应根据所测病原体而定。如：定量PCR对结核分枝杆菌的检测，应选择患者血脑脊液、胸腹水等标本，不宜用痰标本，因为痰中结核分枝杆菌分布不均。;PCR检测衣原体时，由于衣原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞，无论男女取材均应用特制的拭子，男性应进入尿道2-3cm，女性应进入子宫颈口2cm并停留片刻后取出，在分泌物或尿沉渣中检出的阳性率均较低。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。 ;（3）采样质量的评价可通过几个方面来评价标本采集质量，即细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和化学分析等。（4）标本采集中的防污染 标本采集最好采用一次性无菌器材，采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发，表皮细胞、痰液等。如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的RNAase失活。;（5）采样及运输容器 标本的采集材料应一次性使用，运输容器亦应为密闭的一次性装置，采样所用的防腐剂，抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，首先要抗凝，抗凝剂的选择很重要。一般应使用EDTA和枸橼酸盐作为抗凝剂，肝素因其对PCR扩增有很强的抑制作用。;2、标本运送 标本一经采集，应尽可能快的送至检测实验室，实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件作出相应的规定。3、标本保存 由于靶核酸（尤其是RNA）易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。为使临床样本中可能存在的核酸酶失活，可加入chao tropic物质，最常用的是4mol/L异硫氰酸胍盐(Guanidinium isothiocyanae,GITC),并同时与还原剂如β—巯基乙醇或二巯基乙醇一起使用。;使用终浓度为5mol/L的GITC，可使RNase不可逆地失活，加浓度＜4mol/L则失去对RNase的抑制作用，而使RNA迅速降解。使用GITC作为稳定剂保存标本，标本可在室温下稳定约7天。此外，如测定的靶核酸为血循环中的RNA，为避免室温放置过久而致RNA的降解，最好不要使用血清标本，而应使用EDTA抗凝后尽快分离后的血浆标本。临床体液标本长期保存应在—70℃以下。;如为提取核酸后用于DNA扩增分析的标本，可于10mmol/LTris,lmmol/LEDTA(pH7.5~8.0)缓冲液中4℃保存。用于RNA扩增分析的标本，则应于上述缓冲液中—80℃或液氮下保存。核酸的乙醇沉淀物则可于—20℃下保存。