第三章 细胞生物学研究方法 PPT.ppt

第二节 细胞组分的分离及分析技术 一、细胞组分的分离——离心技术 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min。 （一）差速离心 Differential centrifugation 1、特点： ——介质密度均一； ——速度由低向高，逐级离心。 2、用途： 分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核→线粒体→溶酶体与过氧化物酶体→内质网与高基体→核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）pH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。 1、速度沉降velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离的目的。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 2.等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 特点： 1）介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。 2）所需的力场通常比速率沉降法大10～100倍，往往需要高速或超速离心。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 1. 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）显示方法 二、细胞组分的化学染色 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 3. 联苯胺反应：过氧化物酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质。 三、放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 一般用14C和3H标记。常用3H-TdR来显示DNA，用3H-UdR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 ——14C半衰期为5730年，3H为12.5年。 四、显微光谱分析技术 细胞中一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收谱线。 可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。 五、分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（in situ hybridization） 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了荧光探针法。 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 （二）Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核