基因工程-4章 目的基因的制备.pptVIP

第四章 目的基因的制备;一、目的基因的概念 外源基因:插入到载体上并导入到宿主细胞内的特定基因或DNA片段，称为外源基因。 目的基因：通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。 ;目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。;二、获得目的基因的方法 直接分离法 逆转录法 聚合酶链式反应法(PCR法) 鸟枪法 人工化学合成法 基因文库法(基因组文库、cDNA文库) mRNA差异显示法;㈠鸟枪法;鸟枪法的优点： 速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA一亲的有内含子的基因DNA片段。 鸟枪法克隆目的基因的缺点 补平基因缺口困难 排序拼装麻烦，工作量较大 专一性较差 需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构;㈡直接分离法;②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点，用适当的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得目的基因。 ③即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位，也只须先通过酶切分析， 随后再通过部分酶切， 克隆构建一个非常简单的基因组文库，从中钓出目的基因。 ;⑵基因分离的物理化学法;㈢基因的化学合成;从反应机理上讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酰胺法原理设计的。;*;⑴化学合成目的基因的前提条件是基因DNA序列已知 ⑵化学合成的三种策略 ①小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。;②补钉延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段;大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段。;*;⑶DNA化学合成的用途;㈣逆转录法;cDNA第一链的合成;cDNA第二链的合成 ①自身引导法：获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物。;cDNA第二链的合成 ②引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列;㈤PCR法扩增目的基因 ;三、目的基因用途;④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 ⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。 ⑥建立基因疗法，选用某种正常基因，引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。;本章重点掌握的内容