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病毒的细胞培养 赵健乔 一 基本原理 二 细胞培养的基本概念 三 主要优点 四 培养实验用品的前期处理 五 培养细胞的生长方式及类型 六 细胞培养的实验步骤 七 病毒的细胞培养 一 基本原理 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70℃保存备用。 细胞培养的基本概念 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 二 主要优点 ㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。 三 分类 原代细胞培养 传代细胞培养 四 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。 4.细胞培养用液及培养基（液）:  （1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。 （3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 (4) 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素 ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清． 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚． 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 （5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。 （6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U／瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 （7）冻存液：二甲基亚砜 （8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。 其是配方： 基础培养基 80％－90％ 血清 10% 双抗 100u/ml （9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养液。 其是配方： 基础培养基 95％ 血清 2％－5％ 双抗 100u/ml 五 培养细胞的生长方式及类型 ㈠ 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。 ㈡ 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 贴附生长型细胞 细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板 悬浮生长型细胞 六 细胞培养的实验步骤 1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）