端粒酶中RNA突变.pptxVIP

端粒酶中RNA的突变 主要内容1 端粒及端粒酶2 端粒酶中RNA突变及其后果3 影响端粒酶长度和活性的其他因素4 小结1 端粒及端粒酶 三位美国科学家(Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider 和 Jack W. Szostak)因发现“端粒和端粒酶是如何保护染色体的”获得了 2009年的诺贝尔生理学或医学奖。1. 1端粒 真核染色体的末端结构，为一特定的DNA-蛋白质复合体结构。其DNA序列由对生物特异的简单的串联重复单位组成，能抵消每一轮DNA复制中因染色体降解而造成的关键功能码序列的丢失，使正常染色体端部间不发生融合，保证每条染色体的完整性。1.2 端粒酶端粒酶通过引物特异识别位点，以自身 RNA 为模板，在染色体末端合成端粒 DNA，使端粒得以延长，为后续 DNA 聚合酶合成完整的染色体提供了平台。人类端粒酶主要由RNA成分(hTER 或hTR)、端粒酶相关蛋白1(hTEP1)和催化亚单位(hTERT)三部分组成。hTR 长约 451 nt，其中有 11 个碱基(5’ -CUAACCCUAA-3’) 与人 类 端 粒 序列 5’ -TTAGGG-3’互补，与此区互补的反义寡核苷酸能抑制端粒酶活性，而这段 RNA 的突变会导致端粒酶活性的改变。hTEP1 的 mRNA 表达并不限于有端粒酶活性的组织和细胞系，各组织的水平差异与端粒酶的活性无关，因此，端粒酶活性表达并不是由TEP1决定的，但hTERT 则是端粒酶活性所必需的。作为 RNA 依赖的 DNA 聚合酶，区别于一般的蛋白逆转录 DNA聚合酶，hTERT 可识别单链富含G 的寡核苷酸引物，以其RNA 组分的碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，在合成、延伸碱基序列中起催化作用。2.2表达WT和 MT的分析 Northern blotting 来分析所有的hTER转录的分子形态的水平。由于启动子的转录起始位点不同，引进的基因结构（箭头）应该比内生型的hTER（条）长80个碱基。 突变型的基因表达水平明显比野生型的低，野生型的基因在不同的细胞体系中的表达水平差不多。Fig. 4B. Northern blotting analysis of various WT-hTER- and MT-hTer-expressing clonal lines. 2.2表达WT和 MT的分析 1kb的片段经研究表明是具有多聚腺苷酸的片段，300bp的降解产物是多聚腺苷酸。尽管它们在一些细胞系中积累的水平很高，但是不影响细胞的增殖。只有成熟的加工过的端粒酶RNA与端粒酶的活性有关。Fig4( A). Expression of mutant-template telomerase RNA. ( B). Northern blotting analysis of various WT-hTER- and MT-hTer-expressing clonal lines. 2.3细胞培养分析 3H标记的T的结合速率用来定量细胞的增殖。细胞系接种到含有3H标记的T不同的细胞浓度中对其进行18h的培养，野生型与AU5 、49A相比结合的3H标记的T分别高3倍和8倍，虽然U11和WT的统计数据差异不大，但是它降低了长期的细胞增殖率，增加了细胞凋亡。 从长期的培养来看，野生型的无性繁殖系维持快速地细胞增殖，而突变型的基因引起了增殖缺陷。Fig5. MT-hTer expression decreases cell proliferation and viability. (3H-thymidine incorporation)2.4菌落平板分析 菌落平板分析表明 WT 平均的菌落形成效率比AU5 、49A的分别高30倍和12倍，但是U11与WT之间的差别不是太显著。这也证实了细胞培养的结论。 Fig5. MT-hTer expression decreases cell proliferation and viability. (Colony-forming ability assays for LNCaP and MCF-7 clonal lines)2.5细胞周期及表达MT的影响 DNA的sub-G1 水平指示细胞凋亡。流式细胞仪 （细胞生长周期分析 ）分析表明AU5 和 U11 的sub-G1 水平与WT相比明显提高。49A也表现出同样的现象。细胞凋亡和G1（ G0）期细胞循环停滞有助于有突变基因表达引起细胞增殖的降低。 Fig5. MT-hTer expression decreases cell proliferation and viability. (Increased apoptosiscaused byMT-hTer express