第六章_分子生物学研究方法(上)基因工程技....ppt

2、cDNA文库法 （1）cDNA文库的概念： cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。 以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。 从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达成蛋白质。 （2）cDNA文库构建步骤： ① 总RNA提取及mRNA制备： cDNA文库的构建分成以下几个步骤： 真核生物的RNA中80%-85%为rRNA（28S，18S，5S三种类型），tRNA和SnRNA（核内RNA）则占总数的10%-15%，这些RNA可采用电泳、密度梯度离心及阴离子交换法等技术将其分离。 mRNA仅占细胞总RNA的1%-3%，它们大小不一（最大大于7500bp，最小为10 bp），而且核苷酸序列也各不相同，但大多数真核细胞mRNA3，端均由50-250个多聚polyA组成，故可制备多聚polyT与之杂交，形成mRNA-dT杂合体，通过亲和吸附层析，既可获得各种mRNA分子。 ② cDNA文库第一链的合成 mRNA都带有polyA尾巴，以多聚polyT（12-18）为引物，mRNA为模板，在逆转录酶催化下合成与mRNA互补的单链DNA（ss-cDNA），既为第一链cDNA。 ③ cDNA文库第二链的合成 在cDNA第一链的合成后，模板mRNA通常用RnaseH处理降解，然后以第一链为模板