脑心清片及其成分对海马神经元及其L型钙通道的影像分析.docVIP

精品论文 参考文献 脑心清片及其成分对海马神经元及其L型钙通道的影像分析 1.潍坊市市直机关医院 山东潍坊 361000;2.潍坊市第二人民医院 山东潍坊 361041 摘要：目的：研究脑心清及其黄酮成分对海马神经元细胞L型Ca2+通道活性的影响。 方法：采用全细胞记录式(wholecell model)的膜片钳技术记录海马神经细胞L型Ca2+通道电流变化。 结果：槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 mu;g/mL浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞L型钙通道电流(ICa,L)峰值(Plt;0.01)，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%，可使ICa,L 的I-V相关曲线下移，但没有电压依赖性特征，也不改变钙通道的电学特征。结论：脑心清及其黄酮成分对海马神经细胞L型Ca2+通道活性有激活增强作用，有利于神经元细胞内钙稳定，发挥抗缺血再灌注损伤的作用。 关键词：L 型Ca2+通道；脑心清；黄酮；槲皮素；海马神经元；膜片钳技术 在复杂的编码细胞内激活细胞凋亡的信号相互作用中，钙起着重要作用。通过内质网、线粒体和其他信号通路，Ca2+稳态改变与启动细胞凋亡性死亡密切相关[1，2]。Ca2+稳态的调节极其复杂，至今还未明了。近年来研究表明，在控制Ca2+稳态的过程中更精细的变化可能对决定细胞生死有深刻影响。Ca2+稳态可能是凋亡的基本致病过程中的一个药理靶标。 L型Ca2+通道在海马锥体神经元基底树突和胞体都特别集中，其电流占细胞总钙电流的30%～50%。它们的开放和关闭能有效调节细胞浆内Ca2+的水平，而且有证据表明它们还能将钙信号直接传至细胞核。L型Ca2+通道的激活可以直接调控一些对神经元存活及其功能所必需的重要基因的表达，如bcl 2和脑源性神经营养因子等。 脑心清(NXQ)及其有效成分柿叶黄酮(FLDK)都具有抗脑缺血损伤作用],通过上调抗氧化基因bcl2的表达，改善神经细胞氧化还原状态，清除自由基、抗脂质过氧化等方面来发挥其抗缺氧缺血性神经损伤、抗氧化应激和抗兴奋性谷氨酸毒性神经损伤、抗急性脑缺血作用，抑制缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡，保护缺血再灌注引起损伤的脑组织，并能改善缺血再灌注引起损伤的脑组织神经功能。本文研究脑??清及其黄酮成分对海马锥体神经元L型Ca2+通道活性的影响，以探讨在Ca2+稳态调节方面，脑心清及其黄酮成分抗脑缺血损伤神经保护作用的机制。 1 实验材料 1.1受试药 脑心清片用干浸膏(以下简称脑心清、NXQ)，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。脑心清黄酮(FLDK)，由脑心清经聚酰胺树脂吸附分离而得，总黄酮类含量77.35%，其中槲皮素类含量34.625%，山柰酚类含量为42.50%(HPLC测定),代号FLDKP70。用2% NaHCO3 溶液加热到80 ℃溶解成含药25 mg/mL的热溶液。 实验所用溶液的pH均用HCl 和NaOH溶液调至7.2～7.4,并用0.22 mu;m的滤膜过滤除去尘粒和细菌。室温保存，用时加PBS稀释至所需浓度即可。 1.2药品与试剂 阿拉伯糖胞嘧啶、DNA酶Ⅰ、2巯基乙醇、MEM(modified eagle medium)合成培养基、DHanks 平衡盐干粉、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、L谷氨酰胺、多聚赖氨酸(MW70150KD)均为美国Hyclone公司产品。RNase A(Sigma):以1 mg/mL的水溶液,经100 ℃煮沸以灭活DNA酶活性后,分装冻存于-20 ℃备用。 1.3 大鼠新生SD乳鼠,24 h龄，体质量约5.5～10 g，清洁级，合格证号：粤检证字第2003A053号，南方医科大学实验动物中心提供。 1.4 主要仪器LEICA DMLFS倒置显微镜、MO203微电极操纵器(MO203，日本)、Axopatch 200B型膜片钳放大器(美国 Axon Instrument)。 2 实验方法 2.1 新生乳鼠海马神经元的原代培养 无菌条件下，借助于解剖显微镜，取刚出生24 h内的SD乳鼠，分离海马组织，用0.25%胰蛋白酶和0.2%脱氧核糖核酸酶PBS溶液37 ℃孵育消化20 min,并不断摇动,用3倍体积的DMEM培养基分散和冲洗,消化的细胞经200目细胞筛过滤后，200times;g离心5 min,用血球计数板计数细胞,0. 4%台盼蓝镜检存活率大于95%，以1.5 times; 105个/mL的密度种植于涂有多聚赖氨酸(1