心磷脂—细胞色素c体系MCD谱的研究.pdf

维普资讯 固 心磷脂一细胞色素 c体系MCD谱的研究 t{0r0-I＼ 程昆蓉 程伯基 栋克椿 (北 匿再j再生酉!磊弱 室，北京100083) Q]弓7 关键词 ， 查 ()、塑望皇{、M—CD—~} 心磷脂是线粒体 内膜的特征性磷脂，带有 2个负电荷，具有 4条不饱和脂肪酸链．它既与 细胞色素 c特异性结台，又与细胞色素 c氧化酶紧密连接，为其活性所必需．但在 以往的探讨 中，并宋考虑磷脂的影响．从蛋 白与脂相互作用的观点出发，研究嗅蛋 白的功能，除需考虑膜 脂提供 的适宜环境外 ，还应 了解它对蛋 白功能的直接影响．近年来，这方面的工作开始 引起重 视．Schlame等报道，心磷脂与蛋 白作用的特异性部分地依赖于其疏水部分的双键 ． 我们 观察到，电子载体辅酶Q和细胞色素 c的氧化还原状态不 同，对台心磷脂的人工膜流动性影响 各异 1．本工作对加入心磷脂前后细胞色素 cMCD 谱的比较表明：心磷脂可使还原态细咆 色素 c的血 色素铁被氧化 ，自旋状态改变，并使蛋 白的 螺旋构象减少． 一 、 材料与方法 1．材料 牛心心磷脂 (cL)、二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、细胞色素 c为 Sigma产品．其它试 剂均为 A．R．级．反应体系用水为石英管二次蒸馏水，电导 10Q_。． CL纯度测定采用薄层层析 (DC—AlufolienKieselgel60Ft板，CHC11-CH3OH一7mol／L Nt-LOH，体积 比65：30：4和 CHCl3-CHlOH—HAc—HO体积 比85：12．5：12．5：3双向展开 ，66％ H：SO+显色)、元素分析 (美国 P-E 公司 2400型元素分析仪)、原子吸收分光光度法 (AAlO 型和 WFX一1B型原子吸收分光光度计)、极谱法(自制极谱仪，滴汞电极)及红外光谱 (5DX Fourier转换红外谱仪)． 五 还原态细胞色素 c的制备 将 10~mol氧化态细胞色素 c洛于 2．00ml10mmol／Loi-I7．40Tzis-HCl缓冲液，加入 2O0sanol抗坏血酸 ，4℃温育 2h．经 SephadexG-15柱洗脱 ，所得还原态细胞色素 c的吸收 光谱与文献 【4】一致 ． 3．脂质俸制备 用 2：1(V／V)氯仿一甲醇溶剂溶解 DPPC或 CL，经旋转蒸发器在 45~C真空抽去有机溶 剂，使磷脂在心形玻璃瓶壁上形成均匀薄膜．加入适量磷酸缓冲液 (0．10mol／L pbI7．40)，于 45~C水化．用 US-150型探头式超声振荡器冰浴超声振荡为澄清溶液． 脂 浓度 为 1．65× 10-’mol／L． 本文 l991年 4月5日收到．1991年8月 1日收到修改稿． ’ 署家 自然抖学基金资助项 目． 1l0 科 学 通 报 维普资讯 4．MCD 谱的测定 ． 采用 日本 J-500C型 CD 谱议，Imm石英比色皿，磁场强度 15000× 10一T．溯定范匿 I80--700nm，时间常数 I“ 在室温、空气条件下，于 0．10mol／LoH7．40磷酸缓冲液中加人脂质体 (O．33或 1．65× J0-Smol／L)，以终浓度为 8．3×10-~mol／L的细胞色素 c启动反应．图中未注明者，脂质体浓 度均为 133×iO—mollL． 二、结 果 1CL 纯度 元素分析表明 CL 中没