草鱼出血病病毒减毒的研究.pdfVIP

第7卷第3期 上 海 水 产 大 学 学 报 Vo1．7．No．3 1998年9月 JOURNALOF SHANGHAIFISHERIESUNIVERSITY sep．t1998 三 {}一 草鱼出血病病毒减毒的研究 许淑英 李焕 邓国成 姜 兰 白岳强 L — — — — — 一 — — — — — 一 (中国水产科学研究院珠江水产研究所 t广州 510380) 摘 要 草鱼出血病病毒 GCHV一892野毒株在 PSF细胞连续传代过程 ，于培养液中加入一 定浓度的桉液 ．传至 l9代 已选减毒 目的。继续传至29代其减毒效果保持稳定。27代后不再加入桉 液，继续传至37代其减毒效果仍然保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好+免疫原性强 。用该 弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后 ，草鱼的成活率和免疫保护率均选 100％。表明桉液是草鱼出血 病痛毒的一种 良好减毒剂。经按液减毒的GCHAV一892是一株 良好的减毒株。 关键调 草鱼，出血病病毒 ，柱液 ，减毒 中圈分类号 $94 草鱼(Ctenopharyngodonidella)是我国传统的优质养殖鱼类 ，养殖面积广 。但其鱼种阶段 易受出血病危害，成活率低 。草鱼出血病是一种病毒性疾病 ，免疫预防是该病最有效的防治方 法。作者对草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗进行了多年的研究，现己成功地研制出免疫效果良好 的弱毒疫苗[许淑英等 1994]弱毒疫苗的研制关键是要将强毒株进行减毒，最后筛选 出安全 性好、免疫原性 强的弱毒株 。弱毒株可 以通过不同途径和方法获得 [章 以浩等 1966，Kisary 1978]。几年来，作者对草鱼出血病病毒株进行了减毒研究。现将结果综合报道如下。 1 材料和方法 1．1 病毒 具有强毒力的GCHV一892野毒株 (下称892株)来源于珠江三角洲池塘出现典型病症的草 鱼肝、脾、肾组织，取样后作如下处理 ：剪碎、匀浆后用不含小牛血清的199培养液稀释10倍 ， 置冰箱4C预冷 。JTJ100O0rpm离 L,20分钟 ，上清液即为除菌组织病毒液 ，经无菌检验后即可用 于本试验 。 1．2 细胞 由本所建立的草鱼吻端成纤维细胞系PSF是对草鱼出血病病毒敏感的细胞系(李焕林等 1988)。将细胞培养于含10 小牛血清的199培养液 (日本产培养基)中，待细胞长成致密单层后 1998—06—01收到 (1)李焕林 ，许嘏英，邓国成等．1988．草鱼吻端成耋千维细胞系PSF的建立及其生物学特性．中国水产科学研究院学报 (1)，1～ 8． 上 海 水 产 大 学 学 报 7卷 供减毒研究用 。 1．3 药物 在野外采集的细叶桉树叶，用 自来水洗净，室内凉干。称10克老叶并剪成小片，用双蒸水 lOOmL煮沸约2分钟 ，纱布过滤 。补足失去的水分 ，得1O 桉叶药液 (下称桉液)。再经1O磅高压 蒸气消毒3吩 钟 ，置4℃冰箱备用，此即为试验原液 。用时加培养液稀释至所需浓度。 1．4 892株减毒过程观察 取长成致密单层的PSF细胞 ，用0．25 胰蛋白酶和0．02 乙二胺四乙酸二钠混合消化液 消化约1分钟 ，倒掉消化液，加入培养液，用吸管吹打使细胞分散 ，然后加入f棠菌组织病毒液 ，使 病毒最终浓度为1；500。分装入细胞瓶 (细胞浓度1．5×10个 ／rim)。128C培养 。2～3天细胞长 成致密单层。镜检 PSF细胞无产生病变 。根据 出血病病毒感染草鱼后，草鱼的发病时间为1周 左右 ，因而8～10天收获。收获后的细胞病毒液置一7O℃保存 ，作为试验用的细胞毒种。 (1)在 PSF细胞培养液 中加入桉液 ，使桉浓度分别为 1100、1t200、1：500、1：1000、 15000、1；10000。每一试验 (浓度)组和对照组各分装4瓶细胞，置28I]培养 。连续观察96小时， 每隔24小时镜检并记录细胞生长情况 。 (2)在细胞传代和接入病毒的同时，在各组培养液中加入桉液 (病毒的最终浓度为120)，